Characterization of an nf-actin gene in the pathogenic Naegleria fowleri

Abstract

Naegleria fowleri, a pathogenic free-living amoeba has been isolated from samples obtatined from soil,polluted water and chlorinated swimming pool waster and existed as a virulent pathogen which causes fatal primary amoebic meningoencephalitis (PAM) in experimental animal or humans. The cytotoxicity of N. fowleri on target cells requires the contact-dependent mechanism such as a phagocytosis and the contact-independent mechanism such as a secretion of proteases. The phagocytosis mechanisms involve a process of piecemeal ingestion of target cells by food-cups (amoebastomes). Phagocytosis is an actin-dependent process that includes polymerization of monomeric G-actin into filamentous F-actin. Despite the numerous studies concerning with phagocytosis, the detailed role of actin in the N. fowleri food-cup formation has been poorly reported. In this study, we cloned and characterized an nf-actin gene for elucidation of the role of nf-actin in N. fowleri pathogenesis. The nf-actin gene is composed of 1,124 bp and the sequence identity was 82% with nonpathogenic N. gruberi. No sequence identity with other mammals or human actin gene. Immunofluorescence assay using anti-Nf-actin polyclonal antibody developed in BALB/c mice immunized with recombinant protein (rNf-actin fused with His-tag) revealed that the Nf-actin was localized in the cytoplasm and pseudopodia, especially, food-cup structure (amoebastome), of N. fowleri trophozoites. When N. fowleri were co-cultured with CHO cells, the Nf-actin was observed to localize around on phagocytic food-cups. When the Nf-actin protein was inhibited with cytochalasin D, the actin polymerization inhibitor, or nfactin gene knock-downed by transfection with antisense oligomers, N. fowleri trophozoites showed reduced food-cup structures and in vitro cytotoxicity. It suggests that Nf-actin plays an important role in phagocytic activity of pathogenic N. fowleri. In addition, the nf-actin gene was inserted into Ubi-pEGFP-C2 vector for overexpression, and then Ubi-pEGFPC2/ nf-actin was transfected to N. fowleri trophozoites. The strong GFP fluorescence was observed in N. fowleri trophozoites transfected with Ubi-pEGFP-C2/nf-actin, and the expression of EGFP-Nf-actin protein was detected by western blot. The nf-actin overexpressed transgenic N. fowleri showed significantly increasing adherence ability against extracellular matrix components such as fibronectin, collagen I and fibrinogen in comparison to wild type N. fowleri. Moreover, the nf-actin overexpressed transgenic N. fowleri showed increasing phagocytotic ability and cytotoxicity in comparison with the wild type N. fowleri. Finally, these results suggest that the nf-actin gene plays an important role in cell adhesion, phagocytosis and cytotoxicity of N. fowleri.

토양과 담수에서 자유생활을 하는 파울러자유아메바(Naegleria fowleri)는 인체나 실험동물에 원발성 아메바성 수막뇌염을 일으킨다. 파울러자유아메바의 세포사멸기전은 표적세포에 접촉하지 않는 상태에서 아메바의 분비물질에 의해 일어나는 비접촉성기전과 식세포작용처럼 접촉성기전이 있다. 접촉성기전에 의해 표적세포가 용해되는 과정을 trogocytosis라 하며, 이 과정에서 food-cup 혹은 amoebastome이 형성이 된다. 식세포작용은 F-actin과 G-actin의 중합반응을 통한 actin에 의존적인 과정으로 파울러자유아메바의 actin이 식세포작용과의 연관성은 아직 보고된 바 없다. 본 연구에서는 파울러자유아메바의 접촉기전에 관여하는 유전자인 actin에 대해 알아보고자 하였다. 먼저 파울러자유아메바의 actin 유전자를 클로닝하여 1.2 kbp의 아미노산으로 이루어져 있음을 밝혔고, 다른 종의 actin 유전자와의 상동성을 비교하였을 때 비병원성 자유생활아메바인 그루버자유아메바는 82 %의 상동성을 보였지만 다른 포유동물의 actin 유전자의 상동성은 보이지 않았다. 클로닝된 nf-actin 유전자를 E. coli에 형질 도입시켜 50 kDa의 His-tagged 융합 단백질을 얻었다. 이 재조합 단백질을 BALB/c 마우스에 면역시켜 다클론 항체를 얻어 면역형광염색법을 시행한 결과, Nf-actin은 파울러자유아메바 영양형의 세포질내에 분포하며, 특히 food-cup을 형성하는데 관여하는 것을 확인하였다. 표적세포 존재시 Nf-actin의 기능을 알아보기 위해 면역형광염샙법을 시행한 결과, Nf-actin 단백질은 표적세포와 접촉하는 부위에서 형성되는 food-cup에 뚜렷하게 발현되는 것을 관찰하였다. 또한 Nf-actni의 발현이 저해 될 때 나타나는 변화를 알아보기 위해 actin의 중합반응을 저해하는 물질인 CytochalasinD 처리와 knock-down 시스템을 이용한 실험결과, 파울러자유아메바의 food-cup 수가 줄어들고 구조가 변형되었음을 관찰하였다. 파울러자유아메바의 Nf-actin 발현이 억제된 상태에서 표적세포에 대한 세포독성의 변화를 알아보기 위해 LDH 분비를 측정한 결과, 아메바의 세포독성이 감소된 것을 확인하였다. 이를 통해 파울러자유아메바의 세포 골격 형성에 중요한 작용을 하는 Nf-actin은 표적세포와의 접촉 시 식세포 작용을 하는 food-cup 형성에 중요한 역할을 한다고 생각된다. 다음으로 Nf-actin이 과발현된 transgenic파울러자유아메바를 제작하고자 먼저 nf-actin 유전자를 GFP 형성단백질이 포함된 pEGFP-C2 벡터에 클로닝(Ubi-pEGFP-C2/nf-actin)하였다. 클로닝된 Ubi-pEGFP-C2/nf-actin을 PEI를 통해 transfection 한 후, G418을 처리하여 stable transgenic 아메바를 만들었으며, GFP/nf-actin의 발현을 형광현미경과 Western blot을 통해 확인하였다. Nf-actin이 과발현된 transgenic 아메바를 표적세포와 함께 배양한 뒤 LDH 분비 측정법을 통해 세포독성이 대조군에 비해서 증가하는 것을 관찰하였다. 또한 세포외 기질 (ECM; Extracellular matrix components)에 대한 nf-actin이 과발현된 파울러자유아메바의 세포 부착성을 관찰한 결과, fibronectin과 fibrinogen에 대한 세포 부착성이 크게 증가되었다. Zymosan을 이용한 pagocytosis assay를 측정한 결과, nf-actin이 과발현된 transgenic 아메바의 식세포작용이 대조군에 비해 증가됨을 보였다. 또한, nf-actin 유전자의 기능을 억제시키기 위해 antisense nfactin oligomer를 파울러자유아메바에 transfection하여 억제 실험을 확인한 결과, nfactin 유전자의 발현이 억제 되었을 때 표적세포에 대한 세포독성과 ECM에 대한 부착성 그리고 식세포 작용이 저해됨을 관찰하였다. 따라서 본실험을 통해 파울러자유아메바의 접촉성기전과 관련된 nf-actin 유전자는 아메바의 부착성과 세포독성에 중요한 기능을 담당하며 아메바의 병원성 작용기전에 크게 관여하는 것으로 생각된다.