Production of recombinant monoclonal antibodies against HSET

Abstract

HSET (Human Spleen Embryo Testis), belonged to the kinesin 14A family, is a protein required for centrosome clustering during cell division. Since cancer cells with extra-centrosomes could lead to multi-polar division, resulting in genomic instability and cell death, these cancer cells depend on the centrosome clustering activity of HSET that helps normal chromosome segregation by focusing several centrosomes into two poles. As the first step of the strategy to inhibit the function of HSET in cancer cells, we produced mouse monoclonal antibodies (mAbs) against HSET using a hybridoma technique and characterized them. Peptide antigens of 12 amino acid (aa)-length, designed from the regions corresponding to N-terminus (1-134th aa) and C-terminus (626-672th aa) that do not have homology with other kinesin molecules, were used for mouse immunization. Total 28 of mAbs against the peptides from N-terminus HSET were obtained, but no mAb against C-terminus of HSET. In ELISA with the Abs in ascitic fluids against yeast surface displayed HSET, clone 8C346 showed high affinity. In ELISA using Abs purified from hybridoma culture supernatants, clone 1C274, 2C280, 2C281, 6C407, 9C352, and 9C353 showed relatively strong binding to Whole HSET protein. We expect that Abs with high binding to HSET could inhibit HSET function, resulting in selective death of cancer cells.

HSET (Human spleen Embryo Testis)은 키네신 14군에 속한 단백질로서 세포 분열 시 중심체의 군집 (centrosome clustering)에 필수적인 역할을 한다. 세 개 이상의 중심체를 가진 암세포의 경우에는 다극성으로 분열 (multi-polar division) 시, 유전체 불안정성과 세포 사멸을 일으킬 수 있다. 이러한 암세포는 다극성 분열을 회피하기 위해 HSET을 필요로 하는데, 이는 HSET에 의하여 중심체가 군집화 되면 다극성 분열이 억제되고 정상적인 염색체의 분리가 가능해지기 때문이다. 본 연구에서는 암세포에서 HSET의 기능을 저해하기 위한 첫 번째 단계로서, 하이브리도마 기법을 이용하여 생쥐로부터 항-HSET 단클론 항체를 제작하여 항원에 대한 친화성을 분석하였다. 생쥐에 면역하기 위한 항원으로는 다른 키네신과의 상동성이 낮은 HSET의 N 말단 부위 (1-134번째 아미노산)와 C 말단 부위 (626-672번째 아미노산)에 해당하는 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드를 사용하였다. 총 28개의 항체를 얻었으며 모두 HSET의 N 말단에 특이적이었다. 효소면역측정법을 사용하여 생쥐의 복수 속에 존재하는 항체와 효모표면에 발현시킨 HSET과의 결합을 확인했을 때 클론 8C346이 높은 결합력을 보였고, 하이브리도마 배양액으로부터 정제된 항체의 HSET 단백질과의 결합력은 클론 1C274, 2C280, 2C281, 6C407, 9C352, 9C353에서 상대적으로 높게 나타났다. 이들 항체가 HSET의 기능을 억제하여 암세포 특이적인 사멸을 유도할 것으로 기대된다.