Mitochondrial respiratory defects induces claudin 1 expression via ROS-mediated HSF1 activation

Abstract

Claudin-1 (Cln-1) are tight junction components that have recently been reported to be involved in cancer metastasis. Interestingly, we found that SNU human hepatoma cells with mitochondrial dysfunction have high level of Cln-1 expression. In those HCC cells, Cln-1 played a key role in regulating invasiveness. Cln-1 expression was also observed in human hepatocellular carcinoma tissues. In this study, we aimed to elucidate how mitochondrial dysfunction is linked with Cln-1 induction. So, we screened whether any specific mitochondrial respiratory defect induces Cln-1 induction. Among diverse respiratory inhibitors, complex I inhibition by rotenone most effectively induced Cln-1 expression at transcriptional level, accompanied by increase in mitochondrial ROS production. Treatment of H2O2 directly induced Cln-1 expression, implying that Cln-1 induction was mediated by mitochondrial ROS. Interestingly, Cln-1 promoter region (-2700bp ~ +300bp) contained transcription factor binding site Heat Shock Factor1 (HSF1), which are known to be regulated by intracellular redox status. Subsequently, we found, that HSF-1 binds to the Cln- 1 promoter. HSF1 knockdown using siRNA decreased Cln-1 expression and invasive activity in SNU449. These results suggest that Cln-1 induced by HSF1 through respiratory defect mediated ROS in hepatoma cells.

미토콘드리아는 세포가 필요로 하는 에너지 생성을 관장하는 세포 내 소기관이다. 정상세포는 산소가 존재하는 환경에서는 미토콘드리아의 산화적 인산화 과정을 통해 에너지를 생성하고, 산소가 존재하지 않는 경우 해당과정만을 이용해 에너지를 생성한다. 그러나 많은 암세포의 경우, 미토콘드리아의 ATP 생성능력이 저하되어 있는 것이 관찰되어 있고, 산소의 존재 유무와 상관없이 해당과정에 의존적으로 ATP를 합성한다. 이와 같이 암세포에서 관찰되는 미토콘드리아 기능의 저하가 어떠한 기전에 의해 나타나며, 암세포의 증식능력과 전이활성 (invasion)에 어떻게 연관되어 있는지에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 이전보고에서 간암에서 미토콘드리아 기능손상이 밀착연접 단백질의 하나인 Claudin-1 (Cln-1)의 발현을 통해 암세포의 전이활성을 증가시킨다는 사실을 보고하였고, 이를 통해 본 연구에서는 미토콘드리아 호흡기능 손상이 어떤 분자기전에 의해 Cln-1 의 발현을 조절시키는지 규명하고자 하였다. 미토콘드리아 호흡기능 손상 유도 모델로 미토콘드리아 전자전달계 복합체Ⅰ의 저해제인 rotenone 을 정상 간세포주인 Chang 세포에 처리하였다. Cln-1 의 mRNA 와 단백질 발현의 증가가 rotenone 에 의해 유도된 것을 확인하여, 전사수준에서 Cln-1 의 발현이 증가됨을 알 수 있었다. 같은 조건에서 미토콘드리아성 활성산소가 증가되어 있는 것을 활성산소에 의한 Cln-1 발현을 조절하는 것을 확인하였다. 또한 rotenone 에 의해 증가된 Cln-1 의 발현이 항산화제인 N-acetylcysteine 의 전 처리에 의해 소실되는 것으로 보아, rotenone 에 의한 미토콘드리아 손상으로 유도되는 Cln-1 발현증가는 미토콘드리아에서 생성되는 활성산소에 의해 매개되는 것임을 알 수 있었다. 이러한 활성산소에 의해 어떠한 전사조절기전에 의해 Cln-1 의 발현이 조절되는 지를 규명하기 위해, Cln-1 의 -2700bp 에서 +300bp promoter 유전자 서열을 TFSEARCH program을 이용하여 분석한 결과 Heat Shock Factor1 (HSF1) 전사인자의 결합부위가 여러 부분 존재하는 것을 확인하였다. 이를 확인하고자 Chang 세포주에서 rotenone에 의해 HSF1 의 band shift 가 증가하는 것을 확인하였고, 해당 band가 phosphorylation에 의해서 activation 된 band 인지 확인하기 위해 lambda phosphatase처리와 S326 잔기에 인산화된 HSF1 항체로 shift된 band가 HSF1 의 phosphorylation에 의해서 activation 된 band 임을 확인 하였다. 그리고 NAC 처리로 band 의 shift 가 복구되는 것으로 보아 활성산소에 의해 HSF1 의 activitiy 가 조절됨을 알 수 있었다. HSF1 의 활성화에 의해서 Cln-1 이 조절됨을 확인하고자 HSF1 을 Knockdown 과 Overexpression에 의해 Cln-1 발현이 조절됨을 알 수 있었다. 또한 Cln-1 의 promoter 를 이용한 chip assay 와 luciferase assay를 통해 ROS 와 rotenone 에 의해 HSF1의 binding activity 가 조절됨을 확인하여, 이로서 미토콘드리아의 호흡기능 억제에 의한 Cln-1 발현 증가가 활성산소를 매개로 한 HSF에 activation 에 의해 조절된 것임을 알 수 있었다. 미토콘드리아의 기능손상이 저하되어 있고, Cln-1 과 HSF1 의 발현이 증가해 있는 간암세포주인 SNU 449 에서 HSF1 의 Knockdown 에 의해 Cln-1 의 발현이 저하되는 것과 동시에 침투활성이 감소하는 것을 확인하였다. 본 연구를 통해 암세포의 미토콘드리아 기능손상에 의한 활성산소의 증가로 HSF1 의 활성화가 유도되고, Cln-1 의 발현이 증가함으로서 암세포의 침투활성이 증가됨을 알 수 있었다. 이 결과로 미토콘드리아 기능손상이 간암의 악성화에 기여하는 분자기전을 좀 더 구체적으로 이해할 수 있었다. 본 연구로 미토콘드리아 기능 손상을 가지고 있는 간암치료에 대한 새로운 제어타겟을 제시하게 될 것으로 기대한다.