Macrophage recruitment in DRG contributes to sensory axon regeneration after conditioning injury

Abstract

The central branches of the dorsal root ganglia (DRG) sensory neurons do not spontaneously regenerate. It has been known that the sensory neurons can regenerate if their peripheral branches are severed before SCI (conditioning injury, CI). After peripheral nerve injury, macrophages accumulate in DRGs. Recent studies revealed potential roles of macrophages and accompanying inflammatory reactions in axonal regeneration. However, it has not been addressed whether macrophages in DRG play role in CI-induced axon regeneration. In this thesis research, I examined whether the macrophages in DRGs contribute to the CI-induced sensory axon regeneration. Severance of the sciatic nerve resulted in a time-dependent increase of macrophages, proinflammatory cytokines (such as IL-6, IL-1 β, and TNF-α) and macrophageinduced regenerative factors such as various neurotrophins and oncomodulin, which is known to be a proregenerative molecule produced by macrophages in DGRs. Continuous infusion of macrophage deactivator minocycline to L5 DRG for 7 days after CI significantly reduced the number of macrophages, and almost completely abolished expressions of proinflammatory cytokines, neurotrophic factors, regeneration associated genes (GAP-43) and oncomodulin at 7 days after CI. Furthermore, minocycline infusion reduced CI-induced neurite outgrowth in vitro and sensory axon regeneration after CI in vivo. These data suggest that macrophages play an essential role in the CI-induced axon regeneration. Macrophage conditioned media (CM) treated with cAMP did not exhibit neurite-growing activity. Contrarily, CM from neuron-macrophage co-cultures treated with cAMP significantly promoted neurite outgrowth, highlighting the requirement of neuron-macrophage interactions for the induction of pro-regenerative macrophage phenotype. To elucidate signals mediating neuron-macrophage interactions, I performed a chemokine array in DRG samples taken after CI. To elucidate signals mediating neuron-macrophage interactions, I performed a chemokine array in DRG samples taken after CI. I identified a novel chemokine signaling mediated by CCL2 that links regenerating neurons and macrophage activation with proregenerative phenotypes in the CI model. The expression level of CCL2 was significantly increased in injured DRG neurons, and cAMP significantly upregulated CCL2 expression in DRG neuron culture. Adding neutralizing antibody against CCL2 in neuron-macrophage co-culture profoundly reduced the proregenerative activity of CM. Moreover, intraganglionic CCL2 neutralizing antibody injection abolished CI-induced enhanced neurite outgrowth. I demonstrated that neuronal CCL2, but not CCL2 from macrophages, is responsible for the neuron-macrophage interaction using the cocultures of primary neurons or macrophages from CCL2 knockout mice. Intraganglionic injection of recombinant CCL2 induced increases of macrophage infiltration in the DRGs and enhanced neurite growth of the DRG neurons taken at 7 days after the injection. Injection of either fractalkine or CCL3 failed to enhance neurite outgrowth while both chemokines were sufficient to increase the number of macrophages in the DRGs. The differential effects are probably due to differential macrophage polarization, because CCL2 instructed macrophages to take on M2 phenotype whereas M1 polarization was dominant by the fractalkine and CCL3 in primary macrophage cultures. I also tested whether CCL2 can mimic CI effects on in vivo axon regeneration after spinal injury. Since the enhanced capacity of neurite growth by intraganglionic CCL2 injection was significantly diminished by 4 weeks after the injection. I tested if adeno-associated virus serotype 5 (rAAV5) mediated overexpression of CCL2 can lead to long-lasting enhancement of axon regeneration capacity. Neurite outgrowth of the DRG neurons taken at 4 weeks was significantly increased by the intraganglionic rAAV5-CCL2 injection compared to control rAAV5-GFP injection. Furthermore, overexpression of neuronal CCL2 in DRGs by intraganglionic rAAV5-CCL2 injection enhanced sensory axon regeneration in vivo. This study suggests that chronic elevation of CCL2 level in DRG neurons can enhance long-lasting regenerative capacity. Based on the data obtained from my thesis research, I propose that manipulation of CCL2 signaling and the neuron-macrophage interactions may lead to a novel therapeutic approach to promote axon regeneration after CNS injury.

중추 신경의 재생은 거의 일어나지 않는 것으로 알려져 왔지만, 최근에 중추신경의 손상 이전에 좌골신경을 손상 시킴으로 인해 감각신경세포의 재생이 일어나게 하는 좌골신경 조건손상 방법이 시도되고 있다. 좌골신경 손상 이후, 후근 신경절로 활성화 된 대식세포들이 침투되고 이러한 현상에 의해 중추신경계의 신경세포의 재생이 일어난다는 연구 결과가 보고 되었다. 그러나 손상 받은 중추신경의 재생에 있어, 좌골신경 손상에 의해 발생하는 대식세포의 역할이나 염증반응에 의한 정확한 메커니즘은 여전히 명확하지 않으며 치료의 목적으로 적용하는 것은 아직까지 극복해야 할 요소들이 많이 남아 있다. 따라서 본 연구자는 좌골신경 손상에 의해 활성화 된 대식세포의 정확한 기전과 역할을 밝혀 아직까지 효과적인 치료법이 없는 척수 질환의 치료법 개발을 연구 하였다. 첫 번째 연구에서는 대식세포를 불활성화 시키는 minocycline을 이용하여, 좌골신경 조건손상 이후 후근 신경절로 침투하는 대식세포가 신경세포의 재생에 필수적인 역할을 하고 있다는 것을 확인 하였다. 좌골신경조건손상 이후에 minocycline을 지속적으로 후근 신경절에 주입하며 대식세포를 불활성화 시켰을 때 좌골신경 조건손상에 의해 유의미하게 증가했던 재생 촉진 인자들과 재생 관련 유전자들이 완벽하게 감소하였고 또한, 중추신경계의 감각신경세포 재생이 현저하게 줄어들었다. 이전 연구에서, cAMP를 후근 신경절에 주입하여 감각신경세포의 재생능력을 상승시켜 좌골신경 조건손상에 의한 중추신경계의 감각신경세포재생을 재현하였다. 본 연구에서는 후근 신경절 내 cAMP주입에 의해 대식세포가 활성화되고 재생 촉진 인자들과 재생 관련 유전자들이 상승하는 것을 확인하였고, 이러한 현상들은 minocycline 에 의해 완벽히 줄어들었다. 또한, cAMP에 의해 대식세포가 어떠한 재생촉진인자를 분비하는지 알아보기 위해 대식세포를 배양하여 cAMP를 처리 한 후, 적응 용 배지(conditioned media)를 이용해 축삭 재생실험을 하였다. 그러나, 신경세포나 대식세포만을 배양하여 cAMP를 처리 한 적응 용 배지는 축삭 재생에 영향을 주지 않았고, 신경세포와 대식세포를 함께 배양하여 cAMP를 처리 한 적응 용 배지는 축삭 재생을 촉진하였다. 그러므로 첫 번째 실험 결과는 좌골신경 조건손상 이후 감각신경세포들의 재생에 있어서 신경세포와 대식세포의 상호작용이 중요한 역할을 하고 있다는 것을 시사한다. 따라서, 두번째 연구에서는 신경세포에서 분비되는 대식세포 화학주성을 가진 케모카인(chemokine)인 CCL2가 신경세포와 대식세포간의 신호전달 매개물질 이라는 것을 동정하였다. 좌골신경 조건 손상에 의해 일어나는 축삭 재생이 CCL2 유전자 변형 실험용 생쥐에서는 일어나지 않았고, 좌골신경 손상 이후 CCL2 무력화 단백질을 후근 신경절 내에 주입 하였을 때, 후근 신경절내로 침투하는 대식세포의 수가 줄어들었을 뿐만 아니라 축삭의 재생도 전혀 일어나지 않음을 확인하였다. 반대로, 좌골신경 손상 없이 CCL2 재조합 단백질(recombinant CCL2 protein)만을 후근 신경절 내에 주입 하였을 때에는 후근 신경절로 침투하는 대식세포의 수가 유의미하게 늘었을 뿐만 아니라 축삭의 재생도 확연히 증가 한 것을 확인하였다. 또한, 대식세포 화학주성을 가진 다른 케모카인을 후근 신경절 내로 주입 하였을 때, 후근 신경절로 대식세포의 침투는 이루어졌으나, 축삭 재생을 향상시키지는 못하였다. 또한, CCL2에 의해 대식세포의 표현형이 대체 활성화(alternatively activated)된 M2 형으로 분극화하였고, 다른 케모카인에 의해서는 M2 형으로 분극화되지 않았다. CCL2에 의한 대식세포의 표현형의 분극화는 좌골신경 조건손상에 의해 나타나는 현상과 동일하였다. 따라서 이 실험은 좌골신경 조건손상 이후 후근 신경절 내의 신경세포에서 분비되는 CCL2에 의한 신경세포와 대식세포간의 상호작용이 신경재생에 있어서 중요한 역할을 하고 있음을 나타낸다. 이전 연구에서, 후근 신경절 내 CCL2 재조합 단백질 주입에 의한 축삭의 재생을 확인 한 바 있다. 하지만 이러한 현상은 장기적으로 지속이 되지 않았다. 그래서, 세 번째 연구에서는 AAV serotype5-CCL2 를 후근 신경절 내에 주입하여 장기적으로 후근 신경절의 신경세포에서 CCL2를 과 발현시켰다. 좌골신경 조건손상 없이, AAV5-CCL2 바이러스에 의해 장기적으로 과 발현되는 CCL2에 의해 일어나는 축삭의 재생과 후근 신경절로 침투하는 대식세포 수의 증가를 바이러스 주입 4주 후 확인하였고 이러한 현상은 좌골신경 조건 손상과 유사하였다. 또한, 좌골신경 조건 손상 없이 AAV5-CCL2에 의해 후근 신경절 에서의 CCL2 과발현을 통해 척수손상 후, 중추신경계에서의 신경재생을 확인하였다. 이러한 결과는 좌골신경 조건화 손상에 의해 야기되는 손상 받은 척수의 신경세포 재생이 일어나는 것과 유사하였다. 이 실험을 통해 후근 신경절 내 신경세포에서의 CCL2발현을 증가는 신경세포의 지속적인 재생이 가능하다는 것을 밝혔다. 이번 연구에서 본 실험자는 좌골신경 조건 손상 이후 일어나는 감각신경세포 재생에 있어서 CCL2를 매개로 하는 신경세포와 대식세포의 상호작용이 중요한 역할을 하고 있음을 증명하였다. 또한, 본 연구를 통해 CCL2 신호전달체계, 또는 CCL2에 의한 신경세포와 대식세포의 상호관계가 손상 받은 중추신경세포의 재생을 촉진하는 새로운 치료적 대상이 될 수 있음을 시사하였다.