Role of PARK2Gene in Maintenance of Pancreatic Beta Cell Functions

Abstract

Type 2 diabetes (T2D) is characterized by decreased insulin secretion and action. Although many studies have reported the genetic loci/genes for susceptibility to T2D, the vast majority of genetic factors in T2D are still unknown. Mitophagy, a selective elimination system for impaired mitochondria, plays a key role in mitochondrial quality control. Defects in mitophagy that contribute to causing mitochondrial dysfunction have been recently suggested to be involved in the pathogenesis of T2D as well as in neurodegenerative diseases. By performing a candidate-gene association analysis of the single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the 28 mitophagy-related genes with glucose- and insulin-related quantitative traits in the Korean study cohort (7,551 subjects), I found that two SNPs, rs10455889 and rs9365294, in the PARK2 gene encoding an E3 ubiquitin-protein ligase (parkin) were significantly associated with fasting plasma glucose levels and insulin secretion indices in response to glucose stimulation in men (3,747 subjects). Replication analysis in two other Korean cohorts and a European-descendent cohort revealed that genetic variants in the PARK2 gene were associated with glucose homeostasis-related quantitative traits in three cohorts. One variant showed a meaningful linkage disequilibrium correlation to the two discovered PARK2 SNPs. The PARK2 gene is known to be mutated in certain cases of familial Parkinson’s disease. Nevertheless, my results indicated a close relationship between the PARK2 gene and pancreatic β-cell dysfunction-related T2D. In order to prove this finding experimentally, I first investigated whether the PARK2 gene is expressed in the pancreatic tissues. Gene expression profiling of the Park2 gene in rats showed its predominant expression in the pancreatic islets as well as in the brain, skeletal muscle, and liver tissues. Next, I performed a functional analysis to investigate whether the alterations in PARK2 gene expression have an influence on insulin-producing pancreatic β-cell functions. Downregulation of the Park2 gene by RNA interference in rat INS-1 β-cells resulted in a significant decrease in the transcriptional and translational insulin gene (Ins1) expression levels and glucose-stimulated insulin secretion. The mRNA levels of the genes Pdx1, Mafa, Mafb, Nkx2-2, Nkx6-1, Pax4, and Irs1 that encode the pancreatic transcription factors were significantly decreased in the Park2-depleted INS-1 β-cells. In addition, the INS-1 β-cells lacking parkin exhibited decreased intracellular ATP level and mitochondrial membrane potential (mΔψ) but increased reactive oxygen species production and mitochondrial fragmentation. This finding is particularly important because I have provided both population-based statistical and experimental evidence to support the claim that the mitophagy-regulating PARK2 gene plays an important role in the maintenance of pancreatic β-cell function as well as in the maintenance of neuronal cell function.

제 2 형 당뇨병은 환경적 요인과 유전적 요인이 모두 관여하며 다인자성 복합질환으로, 베타-세포의 기능 저하와 질량 감소 등을 동반하는 베타-세포사멸이 주요 병인인 것으로 알려져 있다. 최근의 연구에서 미토콘드리아의 기능 이상이 제 2 형 당뇨병의 인슐린 분비와 민감도에 큰 영향을 미친다고 보고되고있다. Mitophagy(미토콘드리아성 자가포식)는 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하여 세포의 미토콘드리아 질 관리(mitochondrial quality control)에 관여하는 시스템으로 미토콘드리아 항상성 조절에 핵심 역할을 하는 것으로 잘 알려져있다. 미토콘드리아의 손상에 의한 기능 이상이 발생하면, 우선 parkin 이PINK1을 매개로 하여 미토콘드리아 막으로 모이게 되고, 손상된 미토콘드리아는 다양한 단백질이 관여하는 mitophagy 기전에 의해 제거되어 에너지원으로 재사용된다. 본 연구에서는 mitophagy 와 제 2 형 당뇨병과의 관련성을 밝히는 것을 목적으로 연구를 수행하였다. 한국인 KARE 코호트(7,551 명)의 유전형과 임상정보 자료를 이용하여 지금까지 알려진 28 종의 mitophagy 관련 유전자의 394단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)과 공복 시 및 포도당 섭취시의 혈중 포도당 및 인슐린 수치와 인슐린 분비능과의 연관성 분석(association study)을 수행하였다. 그 결과 PARK2 유전자의 2 개의 SNP(rs10455889 와 rs9365294)가 fasting plasma glucose level (p=∼1.2×10-4), insulin secretion indices(p=∼7.4×10-5)과 통계적으로 유의한 연관성을 나타내었다. 다른 한국인 코호트와 유럽인-후손 코호트의 자료를 이용한 재현성 연구(replication study)에서도 PARK2 유전자가 혈당 조절과 관련된 표현형과 연관 관계가 있음을 밝혔다. 따라서 후속연구는 PARK2 유전자에 초점을 맞추어 진행하였다. 우선 PARK2 유전자의 조직 별 발현양상을 조사하였다. Rat 의 각 조직에서 parkin 항체를 이용한 Western blotting 분석을 통하여 Park2 유전자의 단백질 발현량을 조사한 결과, 췌장 소도(pancreatic islet)에서 parkin 발현량이 매우 높다는 사실을 밝혔다. 또한 세포 실험에서 췌장의 베타-세포에서 parkin 단백질이 발현한다는 사실을 밝혔다. 이러한 결과는 PARK2 유전자가 췌장의 베타-세포 기능에 중요한 역할을 하는 것을 시사하였다. 다음은, 인슐린 분비 INS-1 베타-세포에서 Park2 유전자의 역할 규명을 위한 기능연구를 수행하였다. INS-1 베타-세포에서 siRNA 처리에 의해 Park2 유전자의 발현을 억제하였을 때, Park2-knock down 세포 내 인슐린 유전자(Ins1)의 mRNA 발현량 및 단백질 생성량이 모두 감소하였으며, 포도당 처리 시의 인슐린 분비량에도 현저한 감소를 나타내었다. Park2-knock down 세포에서 인슐린 유전자 발현 감소의 기전을 밝히기 위한 췌장 전사인자들의 발현 변화를 관찰한 결과, Pdx1, Mafa, Mafb, Nkx2-2, Nkx6-1, Pax4, Irs1 등의 췌장 전사인자들의 mRNA의 발현량이 현저히 감소되는 것을 확인 하였다. 이러한 결과는 인슐린 유전자의 발현량 감소는 Ins1 전사인자를 포함한 췌장 전사인자들의 발현량 감소의 영향이 있음을 시사한다. 또한, Park2 유전자의 발현 억제로 인하여 세포 내 ATP 수치와 미토콘드리아 막 전위가 감소하였으며, 미토콘드리아의 단편화와 ROS 생성이 현저히 증가하였다. 특히, 미토콘드리아의 형태와 기능에 영향을 미치는 Drp1, UCP2, α–synuclein 단백질량이 미토콘드리아에서 현저히 증가하였다. 이러한 결과로부터 미토콘드리아의 기능 이상이 인슐린 생성과 분비에 큰 영향을 끼친다는 사실을 증명하였다. 상기의 연관성 분석을 통한 통계적 연구결과와 Park2 유전자 발현조절을 통한 실험적 연구 결과로부터 PARK2 유전자는 인슐린 생성과 분비 등의 췌장 베타-세포의 기능 유지에 중요한 역할을 한다는 새로운 사실을 밝혔다. 본 연구에서는 미토콘드리아 질 관리에 중요한 역할을 하는 PARK2 유전자가 제 2 형 당뇨병의 병인과 밀접한 연관 관계를 있음을 처음으로 밝혔다. 향후 제 2 형 당뇨병의 발병기전에 관여하는 유전 요인의 규명에 크게 기여할 것으로 기대된다.