Investigation on the Molecular Mechanism of Photorejuvenation in Photodynamic Therapy

Abstract

BACKGROUND: The photoaging of the skin is characterized by wrinkles, mottled pigmentation, telangiectasia and malignancies due to the effects of long-term UV exposure. Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality for cutaneous malignant and premalignant condition. Recently, several clinical studies reported that the PDT has photorejuvenation effects on the aged skin. In the previous report, which is examined direct effect of PDT on fibroblast (FB), PDT induced increase of matrix metalloproteinase (MMP)-3 and collagen type Iα through prolonged activation of extracellular signal–regulated kinase (ERK). Increased MMP-3 may induce breakage of old collagen and allow new collagen synthesis. PURPOSE: In this study, I investigated molecular mechanism of photorejuvenation after PDT focused on interaction between keratinocyte (KC), FB, and melanocyte (MC). METHODS: The “low level PDT” condition was used for PDT therapy to the KC, FB, and MC. FBs were stimulated with the KC-conditioned medium taken after PDT and MCs were stimulated with the KC-conditioned medium or FB-conditioned medium taken after PDT. Various kinds of cytokines in the supernatants of KC and FB were evaluated by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). The mRNA level of MMPs, transforming growth factor (TGF)-β and collagen type Iα in the FB were determined by real-time polymerase chain reaction (PCR). The melanin content and dopa oxidase activity of the MC were also evaluated. RESULTS: After stimulating FB with KC-conditioned medium, the mRNA of MMP-1 was decreased and the mRNA of collagen type Iα were increased compare to control. However, MMP-3 and TGF-β were not significantly changed. Among the FB stimulating cytokines, a significant elevation of interleukin (IL)-1α, IL-6, tumor necrosis factor (TNF)-α level in KC supernatants was noted after PDT compared with the untreated controls. TGF-β were not significantly altered after PDT. After PDT, significantly reduced melanin content and dopa oxidase activity were noted compared to the control group after 24 and 48h in MC. In addition, MC treated with KC-conditioned medium taken after PDT showed a significant reduction of melanin content and dopa oxidase activity compared with the control groups. Among the well known MC stimulating cytokines from KC, the level of stem cell factor (SCF) in KC-conditioned medium was significantly decreased after PDT, whereas endothelin (ET)-1 and granulocyte-macrophage colony stimulating factors (GM-CSF) were not significantly altered. MC treated with FB-conditioned medium taken after PDT showed a significant reduction of melanin content and dopa oxidase activity compared with control groups. Among the MC stimulating cytokines from FB, the hepatocyte growth factor (HGF) in FB-conditioned medium was significantly decreased after PDT compared to the untreated control. The SCF and basic fibroblast growth factor (bFGF) were not changed after PDT. CONCLUSION: PDT induced new collagen synthesis may be mediated not only by direct effect of PDT on FB but also by indirect effect of PDT on FB through cytokines from KC. In addition, PDT has inhibitory effect of melanogenesis in the human MC. This inhibitory effect of melanogenesis thought to be regulated indirectly by KC and FB as well as directly by PDT. Decreased secretion of SCF from KC and HGF from FB may have crucial role which induce inhibition of melanogenesis of MC after PDT.

배경: 피부의 광노화란 장기간에 걸친 자외선 노출에 의해 피부에 주름, 색소침착, 모세혈관확장, 피부암 등이 발생하는 것을 말한다. 광역동치료는 피부암과 전암병변을 치료하기 위해 사용하는 방법으로 최근 몇몇 임상 연구에 따르면 광역동치료가 노화된 피부의 광회춘효과를 주는 것으로 보고되고 있다. 섬유아세포에 대한 광역동치료의 직접적 효과를 연구한 이전 연구를 보면 광역동치료에 의해 섬유아세포 내에서 지속적으로 ERK이 활성화 되고 이것은 MMP-3와 collagen type Iα의 증가를 유도하는 것으로 보고 되었다. 증가된 MMP-3는 오래된 collagen을 분해하고 이것은 새로운 collagen 형성을 유도할 것으로 생각된다. 목적: 이 연구에서 저자는 광역동치료에 의한 광회춘 효과의 분자적 기전에 대해 각질세포, 섬유아세포, 멜라닌세포 간의 상호작용을 중심으로 알아보고자 한다. 방법: 각질세포, 섬유아세포, 멜라닌세포에 대한 광역동 치료 시에“저용량 광역동치료”조건을 사용하였다. 섬유아세포는 광역동치료를 한 각질세포 배양액으로 자극했고, 멜라닌세포는 광역동치료를 한 각질세포 배양액 또는 섬유아세포 배양액으로 자극하였다. 각질세포와 섬유아세포 상층액에 있는 다양한 종류의 싸이토카인을 효소면역측정법(ELISA)으로 측정하였다. 섬유아세포 내 MMP, TGF-β, collagen type Iα의 mRNA를 실시간 중합효소연쇄반응(1 real-time PCR)로 측정하였다. 멜라닌세포의 멜라닌 함유량과 dopa oxidase의 활성도도 측정하였다. 결과: 섬유아세포를 각질세포배양액으로 자극한 후 섬유아세포 내 MMP-1의 mRNA가 대조군에 비해 감소하였고 collagen type Iα의 mRNA는 대조군에 비해 증가하였다. 그러나 MMP-3와 TGF-β 는 의미 있는 변화가 없었다. 섬유아세포를 자극하는 싸이토카인 중에서 IL-1α, IL-6, TNF-α 가 각질세포에 광역동치료한 후 각질세포 배양액에서 대조군에 비해 증가되어 있었다. TGF-β는 광역동 치료 후 각질세포 배양액에서 변화가 없었다. 광역동치료 후 멜라닌세포 내 멜라닌 함유량과 dopa oxidase 활성도가 24시간과 48시간에 대조군에 비해 감소하는 것으로 나타났다. 또한 멜라닌세포를 광역동치료한 각질세포 배양액으로 자극한 후에도 멜라닌 함유량과 dopa oxidase 활성도가 대조군에 비해 감소하는 것으로 나타났다. 각질세포에서 분비되어 멜라닌세포를 자극하는 것으로 알려진 싸이토카인들 중에서 SCF가 광역동 치료 후 각질세포 배양 상층액에서 의미있게 감소되어 있는 것으로 측정되었고 ET-1과 GM-CSF는 변화가 없었다. 멜라닌세포를 광역동치료한 섬유아세포 배양액으로 자극한 후에 역시 멜라닌 함유량과 dopa oxidase 활성도가 대조군에 비해 감소하는 것으로 나타났다. 섬유아세포에서 분비되어 멜라닌세포를 자극하는 것으로 알려진 싸이토카인들 중에서 HGF가 광역동 치료 후 각질세포 배양 상층액에서 의미있게 감소되어 있는 것으로 측정되었고 SCF와 bFGF는 변화가 없었다. 결론: 광역동치료는 새로운 collagen 생성을 유도하는데 이는 광역동치료가 섬유아세포에 미치는 직접적인 영향뿐 아니라 각질세포에서 분비되는 싸이토카인에 의한 광역동치료의 섬유아세포에 대한 간접적인 영향에 의해서도 발생하는 것으로 생각된다. 본 저자는 또한 광역동치료가 1 멜라닌세포에서 멜라닌 형성을 억제한다고 제안한다. 이 멜라닌 형성 억제 효과는 광역동치료가 멜라닌세포에 미치는 직접적인 영향뿐 아니라 각질세포와 섬유아세포에 의한 광역동치료의 멜라닌 세포에 대한 간접적인 영향에 의해서 발생하는 것으로 생각된다. 각질세포에서 분비되는 SCF와 섬유아세포에서 분비되는 HGF가 광역동치료 후 멜라닌세포의 멜라닌 형성 억제를 유도하는 주요 싸이토카인으로 보인다.