Association and functional studies of genetic polymorphisms of MFGE8 gene in systemic lupus erythematosus

Abstract

BACKGROUND: Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by impaired clearance of apoptotic cells. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) is a protein connects between αvβ3 integrin of phagocytic macrophage and phosphatidylserine (PS) of apoptotic cell surface. Previous studies have reported that MFG-E8 deficiency causes lupus-like disease in murine models. However, MFG-E8 serum level was reported to be elevated in SLE patients. In this study, we determine whether genetic variation of MFGE8 gene and serum protein concentration are associated with SLE. MATERIALS AND METHODS: We collected the blood samples from SLE patitents (n = 280) and normal controls (NC, n = 260) at the rheumatology clinic of Ajou University Hospital. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) were genotyped by three steps. At first, we used polymerase chain reaction (PCR) in 20 SLE patients and 20 normal controls (NC) for sequencing of a whole MFGE8 gene in Korean population. Then we screened twelve selected SNPs in 55 SLE patients and 30 NC. Furthermore we used Taq-man probe assay in 225 SLE patients and 230 NC for genotyping of targeted five SNPs. For the PCR assays, we extracted genomic DNA from whole blood. Also, we collected the all SLE patient's clinical characteristics, laboratory and medication data. Furthermore, we analyzed using sandwich ELISA and immunoblotting for comparing serum MFG-E8 concentration in SLE patients. All of results analyzed using SPSS 23.0 and R 3.2.5 statistical programs. RESULTS: Total five SNPs were identified with whole gene sequencing. All SLE patient's mean age was 35.7 ± 7.8 years and 92% were women, which is not different form NC (28.1 ± 7.4 years and 93%, respectively). rs2271715's C allele and rs3743388's G allele were shown higher frequency in SLE than NC (p-value = 0.036, p-value = 0.005, respectively). As the linkage disequilibrium test, rs1878326 and rs1878327 were shown high linkage (r2 score was 0.879). Three haplotypes were found by four SNPs (rs1878326, rs1878327, rs2271715, and rs3743388); AACG, CGCG, and CGTC. The CGCG haplotype was significantly higher in SLE patients compared with NC (p-value = 0.001, odds ratio = 2.312). rs4945 was associated with erythrocyte sedimentation rate, and rs1878326 was assiciated with C-reactive protein (CRP), andi-double stranded deoxyribonucleic acid (anti-dsDNA) antibody, systemic lupus erythematosus disease activity (SLEDAI) score and steroid cumulated dose, and rs1878327 was associated with alopecia, CRP, complement 3, anti-dsDNA antibody and SLEDAI score. rs2271715 and rs3743388 were associated with renal disease, steroid cumulated dose, cyclophosphamide and mycophenolate mofetil dose and rs3743388 also was associated with anti-dsDNA antibody. Serum MFG-E8 concentration was shown significantly higher in SLE than NC (2,030.3 ± 1,292.3 pg/mL vs 1,433.0 ± 946.3 pg/mL, p-value = 0.017). Also, MFGE8 gene's rs4945‘s A allele and rs2271715's C allele were shown higher MFG-E8 concentration in SLE patients than NC (5136.1 ± 2140.5 pg/mL vs 1254.8 ± 480.4 pg/mL, p = 0.035; 2460.2 ± 1158.3 pg/mL vs 1571.6 ± 461.1 pg/ml, p-value = 0.004). CONCLUSIONS: Our data suggest possibility that MFGE8 rs2271715 and rs3743388 SNP can be involved in susceptibility of SLE. Also, these SNPs are associated with renal disease and disease activity in SLE. Furthermore, rs4945, rs1878326 and rs1878327 polymorphisms may be a marker of disease activity.

목적: 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus)는 만성적인 염증 반응으로 인하여 우리 몸의 여러 조직들이 파괴되는 임상적인 특성을 가지며 다양한 자가항체를 생성하는 비정상적 면역반응을 유도하는 전신적인 자가면역 질환이다. 이러한 자가면역 질환에 있어서 사멸세포의 제거는 자가항원을 제거하고 강력한 항염증 및 면역억제 효과가 있기 때문에 자가면역 유도의 예방에 있어서 매우 중요하다. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8)은 젖분비선과 유지방구에서 많이 발현되는 당단백질로 알려져 있다. 이 단백질은 대식세포에서 발현되며 대식세포와 사멸세포 사이의 가교 역할을 하고 사멸세포의 제거에 관여한다. 본 연구자는 한국인 전신홍반루푸스 환자에서의 MFGE8 유전자 다형성과 전신홍반루푸스와의 연관성을 알아보고, MFG-E8 단백질 발현량과 전신홍반루푸스 질병활성도와의 관련 여부를 확인하고자 하였다. 재료 및 방법: 아주대학교병원 류마티스내과에서 진단받은 한국인 전신홍반루푸스 환자 280명과 정상 대조군 260명을 연구대상자로 선정하였다. 전신홍반루푸스 환자군 280명의 평균 연령은 35.7세, 정상 대조군 260명의 평균 연령은 28.1세이었으며 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 남녀 성비는 남성(21명, 7.5%)보다 여성(259명, 92.5%)의 비율이 더 높았으며, 정상 대조군의 성비 또한 남성(19명, 7.3%)보다 여성(241명, 92.7%)의 비율이 더 높았다. 연구대상자들의 전혈을 사용하여 genomic DNA를 추출하였고, 또한 전신홍반루푸스 환자의 임상적인 특징과 혈청 검사 결과, 약물 치료력 정보를 수집하였다. 추출한 genomic DNA를 polymerase chain reaction (PCR) 방법을 사용하여 20명의 한국인 전신홍반루푸스 환자와 20명의 정상 대조군의 전체 DNA 염기서열분석을 수행하여 12개의 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)을 선정하였다. 그 후에 35명의 한국인 전신홍반루푸스 환자와 10명의 정상 대조군에서 12개의 SNP에 대한 DNA 염기서열분석을 수행하여 5개의 target 단일염기다형성을 선정하였고, Taq-man probe assay 방법을 이용하여 225명의 한국인 전신홍반루푸스 환자와 230명의 정상 대조군의 염기서열분석을 통하여 유전자의 단일염기다형성과 질환과의 연관성을 통계분석 하였다. 또한 연구대상자의 혈청에서 immunoblotting과 sandwich ELISA를 수행하여 전신홍반루푸스 환자군과 정상 대조군 간의 MFG-E8 단백질 발현량을 비교하여 전신홍반루푸스 질병활성도와의 연관성을 통계분석하였다. 실험 결과의 통계 분석은 SPSS 23.0과 R 3.2.5 통계 프로그램을 사용하여 수행하였다. 결과: 전신홍반루푸스 환자군와 정상 대조군에서 MFGE8 유전자의 전체 유전자 DNA 염기서열분석을 통하여 5개의 단일염기다형성을 선정하였다 (rs4945, rs1878326, rs1878327, rs2271715, rs3743388). 그 중에서 rs2271715의 C allale과 rs3743388의 G allele이 정상 대조군에 비해 전신홍반루푸스 환자군에서 통계적으로 유의하게 높은 빈도로 나타났다 (p-value = 0.036 and 0.005, respectively). 각 단일염기다형성들 간의 연관성 여부를 확인하기 위하여 연관불균형 (linkage disequilibrium) 검사를 실시한 결과, rs1878326과 rs1878327 단일염기다형성이 r2값 0.879로 높은 연관을 보였다. 4개의 단일염기다형성으로 하플로타입 (haplotype)을 만든 결과, 3개의 하플로타입 (AACG, CGCG, CGTC)이 만들어졌고 그 중 CGCG 하플로타입이 전신홍반루푸스 환자와 정상 대조군 간에 p-value 0.001로 통계적으로 유의한 차이를 보였고, odds ratio는 2.312의 위험도를 나타내었다. 또한 전신홍반루푸스 환자의 임상적 특징들과 이 단일염기다형성들 간의 상관관계를 분석한 결과 rs4945 단일염기다형성은 적혈구침강속도 수치와 통계적으로 유의한 차이를 보였고, rs1878326은 C-반응단백과, andi-dsDNA 항체, SLEDAI 점수, steroid 복용량과 각각 통계적으로 유의한 차이를 보였다. rs1878327 단일염기다형성은 탈모 빈도와 C 반응 단백, 보체 C3, anti-dsDNA 그리고 SLEDAI 점수와 각각 통계적으로 유의한 차이를 보였다. rs2271715와 rs3743388 단일염기다형성은 신장질환의 빈도, steroid 복용량, cyclophosphamide 투여량, mycophenolate mefetil 복용량과 유의한 차이를 보였을 뿐만 아니라 rs3743388는 anti-dsDNA 항체와도 통계적으로 유의한 차이를 보였다. MFG-E8 단백질 발현량은 정상 대조군에 비해 전신홍반루푸스 환자군에서 더 높았다 (2,030.3 ± 1,292.3 pg/mL vs 1,433.0 ± 946.3 pg/mL, p-value = 0.017). 두 실험군의 MFGE8 단일염기다형성과 단백질 발현량 간의 상관관계를 확인한 결과, 특히 rs4945의 A allele와 rs2271715의 C allele을 가진 전신홍반루푸스 환자군에서 같은 유전자형을 가진 정상 대조군에 비해 MFG-E8 단백질 발현량이 유의하게 높은 수치를 보였다 (5136.1 ± 2140.5 pg/mL vs 1254.8 ± 480.4 pg/mL, p-value = 0.035; 2460.2 ± 1158.3 pg/mL vs 1571.6 ± 461.1 pg/mL, p-value = 0.004). 결론: MFGE8 유전자의 단일염기다형성은 한국인 전신홍반루푸스의 발병과 질병활성도와 연관이 있는 것으로 밝혀졌으며, 향후 질병 진단이나 질병활성도와 관련한 생체표지자로서 활용 가능할 것으로 기대된다.