Novel mechanism of gastric proton pump inhibitor (PPI) : Suppression of Helicobacter-pylori induced angiogenesis and selective induction of apoptosis in gastric cancer cells.

Abstract

To survival in an ischemic microenvironment with a lower extracellular pH, ability to up-regulate proton extrusion is critical for cancer cell survival. Gastric H+/K+-ATPase exchanges luminal K+ for cytoplasmic H+ and is the enzyme primarily responsible for gastric acidification. On the basis of the fact that blocking the clearance of acidic metabolites are known to induce the cell death, we hypothesized that pantoprazole (PPZ), one of gastric H+/K+-ATPase inhibitors used frequently to treat acid-related diseases, could inhibit growth of tumor cells. And, although activation of mitogen activated protein kinases (MAPKs) by Helicobacter pylori infection is associated with induction of host angiogenesis, which may contribute to H.pylori associated gastric carcinogenesis, the strategy for its prevention has not been identified. As we previously reported a strong inhibitory action of gastric proton pump inhibitors (PPIs) on MAPK extracellular signal regulated kinase (ERK) 1/2 phosphorylation, we investigated whether PPIs could suppress the H.pylori induced angiogenesis via inhibition of MAPK ERK1/2. To detect PPZ-induced apoptosis, we performed that Genomic DNA fragmentation, terminal deoxynucleotidyl transferase (Tdt)-mediated nick end labeling assay, and annexin V staining. And mitogen-activated protein kinase activation and heat shock proteins expression were determined by immunoblot with specific antibodies. The antitumor effect of PPZ was evaluated in vivo by a xenograft model of nude mice. And, to address the relationship between H.pylori infection and angiogenesis, comparative analysis of density of CD34+ blood vessel was performed in tissues obtained from 20 H.pylori positive gastritis and 18 H.pylori negative gastritis patients. Expression of hypoxia inducible factor 1 (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) was tested by reverse transcription-polymerase chain reaction and secretion of interleukin 8, and VEGF was measured by ELISA. To evaluate the direct effect of H.pylori infection on the tubular formation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), an in vitro angiogenesis assay was employed. Activation of MAPK and nuclear factor κB was detected by immunoblotting. After PPZ treatment, apoptotic cell death was seen selectively in cancer cells and was accompanied with extracellular signal-regulated kinase deactivation. By contrast, normal gastric mucosal cells showed the resistance to PPZ-induced apoptosis through the overexpression of anti-apoptotic regulators including HSP70 and HSP27. In a xenograft model of nude mice, administration of PPZ significantly inhibited tumorigenesis and induced large-scale apoptosis of tumor cells. And, H.pylori positive gastritis patients showed a higher density of CD34+ blood vessels (mean 40.9(SEM 4.4)) than H.pylori negative gastritis patients (7.2±0.8), which was well correlated with expression of HIF-1α. Conditioned media from H.pylori infected gastric epithelial cells directly induced tubular formation of HUVEC and the increase of in vitro angiogenesis was suppressed by PPI treatment. Infection of H.pylori significantly upregulated expression of HIF-1α and VEGF in gastric epithelial cells and expression of proangiogenic factors was mediated by MAPK activation and partially responsible for NFκB activation. PPIs effectively inhibited the phosphorylation of MAPK ERK1/2 that is a principal signal for H.pylori induced angiogenesis. In conclusion, PPZ selectively induced in vivo and in vitro apoptotic cell death in gastric cancer, suggesting that proton pump inhibitors could be used for selectively anticancer effects. And, the fact that PPZ could downregulate H.pylori induced angiogenesis indicates that antiangiogenic treatment using a PPZ could be a promising protective therapeutic approach for H.pylori associated carcinogenesis.

암세포는 급격한 세포분열을 위한 대사작용으로 인해 암세포내에 많은 양의수소이온이 축적이 되고 세포밖 환경도 배출된 수소이온들로 인해 낮은 pH가 형성되어 있다. 따라서, 대사작용 결과 생성된 수소이온을 세포밖으로 충분히 퍼낼수 있는 능력이 요구된다. H+/K+-ATPase 는 세포내의 H+와 세포밖의 K+를 교환하는 역할을 하여 위의 산성화에 기여하는 효소이다. 이러한 사실들에 기인하여, 우리는 Gastric H+/K+-ATPase inhibitor (위산억제제) 의 하나인, Pantoprazole (PPZ) 을 사용하여 암세포가 수소이온을 세포밖으로 퍼내는 능력을 차단하면, 암세포의 성장을 억제하거나 암세포를 죽일 수 있을 것이란 가정을 세웠다. 그리고, 헬리코박터 파이로리균의 감염으로 인한 mitogen activated protein kinases (MAPKs) 의 활성화가 숙주의 신생혈관생성을 유도하고, 더 나아가 위암화에 기여한다는 것은 많이 알려진 사실이나, 그 과정을 억제하는 방법에 관하여는 밝혀진 것이 많지 않다. 그러므로, 우리는 위산억제제가 MAPK ERK1/2 의 인산화를 강하게 억제하는 능력이 있다는 것을 보고하였기에, 헬리코박터 파이로리균 감염에 의한 MAPK ERK1/2의 활성화를 위산억제제로 억제할 수 있고 그 결과 신생혈관생성도 억제할 수 있는가를 조사해 보았다. PPZ에 의해, 암세포가 세포자사멸에 이르는가를 알아보기 위하여 genomic DNA fragmentation, terminal deoxynucleotidyl transferase (Tdt)-mediated nick end labeling assay, 그리고 annexin V 염색법을 수행하였다. 그리고, Mitogen-activated protein kinase 와 Heat shock protein 의 발현과 암세포의 세포자사멸과의 상관관계를 알아보기 위하여 특정항체를 이용한 immunoblot 을 이용해 검증하였다. 그리고, PPZ가생체내에서 항암효과가 있는지 검증을 위하여 nude mice 를 이용한 Xenograft model 실험을 수행하였다. 그리고, 헬리코박터 파이로리균의 감염과 신생혈관생성과의 관계를 알아보기 위해, 20명의 헬리코박터 파이로리 양성인 환자와 18명의 헬리코박터 파이로리 음성인 환자의 조직절편에서 CD34+ 혈관의 상대적 발현량을 확인해 보았다. 그리고, reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 을 이용해 hypoxia inducible factor 1 (HIF-1α) 와 vascular endothelial growth factor (VEGF) 의 발현량을 비교해 보았고, ELISA 를 이용해 interleukin 8 과 VEGF의 분비도 확인해 보았다. 그리고, in vitro angiogenesis assay 를 이용하여, 헬리코박터 파이로리균의 감염이 human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) 의 혈관모양생성을 직접적으로 유도하는지도 확인해 보았다. 그리고, MAPK 와 nuclear factor κB (NFκB) 의 활성화도 immunoblotting 으로 확인해 보았다. 그 결과로, 암세포에 PPZ를 처리해 주면 세포자사멸에 이르는 것을 확인하였고 이때, extracellular signal-regulated kinase(ERK)의 활성화가 저해되는 것을 확인하였다. 이와 대조적으로, 정상세포에서는 HSP70 과 HSP27 같은 항세포자사멸인자들의 과발현을 통하여 PPZ에 의해 유도되는 세포자사멸에 저항성을 보이는 것을 확인하였다. 그리고, nude mice를 이용한 xenograft model에서도 PPZ의 접종이 암화의 진행을 억제하고, 암세포의 세포자사멸을 유도한다는 것을 확인하였다. 그리고, 헬리코박터 파이로리균 양성인 위염 환자 (40.9±4.4)에서 헬리코박터 파이로리균 음성인 위염 환자 ( 7.2±0.8) 보다 CD34+ 혈관의 발현량이 현저히 증가되어 있는 것을 관찰하였고, HIF-1α 의 발현상관관계도 같은 결과치를 보여주었다. 위상피세포에 헬리코박터 파이로리균을 감염시켜 얻은 배양액을 가지고 HUVEC 세포의 배양액에 혼합하여 배양했을 때, HUVEC 세포가 혈관모양을 생성하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 여기에 위산억제제를 처리해주면 현저하게 HUVEC 세포가 혈관모양을 생성하는 것을 억제해 주었다. 그리고, 헬리코박터 파이로리균의 감염이 MAPK 의 활성화와 전사인자인 NFκB의 활성화를 통해 혈관생성인자인 HIF-1α 와 VEGF 의 발현을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 과정에, 위산억제제가 MAPK ERK1/2 의 인산화를 효과적으로 억제해 헬리코박터 파이로리균의 감염에 의한 신생혈관생성 과정을 억제하는 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로, 위산억제제가 생체내와 세포수준에서 위암세포의 세포자사멸을 유도하고, 헬리코박터 파이로리균의 감염으로 인한 신생혈관생성을 억제하는 능력이 있다면, 이 위산억제제가 더 나아가 항암치료에 이용될 수도 있고, 또한, 헬리코박터 파이로리균과 관계된 위암화의 진행을 억제할 수 있는 치료제로의 역할도 기대해 볼 수 있겠다.