Expression and Functional Analysis of Hepatitis B Virus DNA Polymerase

Abstract

PART I: Expression of chimeric DNA polymerase of human and duck hepatitis B virus Hepatitis B Virus (HBV) DNA polymerase is a multifunctional protein with four domains, terminal protein (TP), spacer, reverse transcriptase (RT), and RNaseH. Since HBV DNA polymerase is very unstable and rapidly degradable, it has been very difficult to study the biochemical aspect of HBV DNA polymerase. In the present study, several chimeras of DNA polymerase by substituting DHBV sequence in the HBV DNA polymerase were constructed to have insights for the nature of HBV DNA polymerase. Also rabbit polyclonal antiserum specific for each domain of HBV DNA polymerase was produced. RNAs of chimeric DNA polymerases, and 2.4 and 2.1 Kbp of surface RNAs were produced by all chimeras but the expression proteins of chimeric polymerases were not detected. The distribution of HBV polyemerase was exclusively localized in cytoplasm and little co-localized between HBV polymerase and the organelles markers such as endoplasmic reticulum, Golgi and peroxisome. When the several chimeric constructs and polymerase deficient mutant that provides pgRNA and HBV proteins except polymerase, were cotransfected to hepatoma cells, all chimeras were incompatible for replication. Interestingly core particle formation varied in chimeric DNA polymerase construct transfected cells. This result suggests that the primary sequence of chimeric DNA polymerase may affect the capability core particle formation or the level of pregenomic RNA. PART II: Down-regulation of hepatitis B virus replication by splicing event Various spliced HBV transcripts have been described in human liver tissues and in HBV-transfected hepatoma cell lines, but their functions are unknown. To analyze the expression and the function of HBV DNA polymerase, HBV DNA polymerase construct was tranfected into hepatoma cells and then several spliced HBV RNAs from expressed HBV DNA polymerase RNA were founded. Since the spliced RNA encoded new viral protein, the polymerase-surface (PS) fusion protein was analyzed in detail. By confocal microscopy with monoclonal antibody specific for surface antigen and polyclonal antiserum specific for TP domain of HBV DNA polymerase, the exclusive expression of PS fusion protein in perinuclear region was detected. Also, intracellular distribution of PS fusion protein was overlapped with nuclear pore complex and vimentin, which is known as intermediate filament providing a perinuclear stable core area, as well as endoplasmic reticulum. Also, HBV small antigen secretion was drastically inhibited even with a small amount of this construct. Since it is possible that PS fusion protein expression might be involved in HBV life cycle by modulating gene regulation through nuclear/cytoplasmic transport like Rev protein of HIV, the spliced RNA only expressing mutant that did not express PS protein to elucidate the modulatory effects of the spliced RNA or the PS fusion protein on HBV life cycle. Core particle formation was blocked by the expression of spliced construct. Also, when the PS fusion RNA expression was increased, HBV DNA synthesis was decreased gradually by endogenous polymerase assay and Southern blot analysis. These data indicate that PS fusion RNA down-regulates HBV DNA synthesis, which distinguishes the HBV large surface RNA with PS fusion RNA. Taken together, these data suggest that PS fusion RNA may modulate the HBV replication, which is different from the reported previously.

목적: B형 간염 바이러스는 세계적으로 주요한 pathogen중 하나로 그들의 복제기전과 구성물의 정확한 생물학적 역할을 이해하는 것은 중요하다. Chimeric DNA 중합효소를 이용하여 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 어느 부위가 복제에 중요한지를 알아보고자 하였다. 재료 및 방법: 사람 B형 간염 바이러스와 오리 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 아미노산 서열을 alignment하여 상호적으로 교체할 부위를 결정하여 inframe으로 사람 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 상응하는 오리 B형 간염 바이러스 부위를 cloning 하였다. 부위별 기능 분석을 위해 사람 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 각 domain을 박테리아에서 발현시켜 토끼에 주사하여 polyclonal 항체를 얻었다. 우선 얻은 항체로 wt 사람 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 세포네 발현과 위치를 immunofluoresence assay를 이용하여 알아보았다. Chimeric DNA 중합효소가 B형 간염 바이러스의 복제와 encapsidation을 재개 할 수 있는지 endogenous polymerase assay와 encapsidation assay를 수행 했으며 chimeric DNA 중합효소 RNA와 단백질의 발현은 Northern blot analysis와 immunofluoresence assay를 통해 알아 보았다. 또한 chimeric DNA 중합효소의 발현이 B형 간염 바이러스 core particle 형성에 미치는 영향을 알아보기 위해 core particle western blot analysis를 시행하였다. 결과: B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 TP (terminal protein) 부위에 특이적인 항체를 얻었으며 이 항체를 이용하여 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 세포네 위치가 cytoplasm 전반에 걸쳐서 존재 하였으며 endoplasmic reticulum, Golgi 그리고 peroxisome에 분포하지 않음을 알 수 있었고 복제를 수행하고 있는 세포에서도 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소와 B형 간염 바이러스의 spliced 단백질을 확인 할 수 있었다. 그러나 chimeric DNA 중합효소 construct는 단백질로서 발현하지 않아 B형 간염 바이러스 복제와 encapsidation이 일어나지 않았다. Chimeric DNA 중합효소 RNA는 core particle 형성에 영향을 주는 것으로 확인 되었다. 결론: 이 연구에서 제작된 TP 특이적 항체는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소 연구에 폭 넓게 이용될 수 있음을 보여 주었고 비록 chimeric DNA 중합효소가 B형 간염 바이러스 복제나 encapsidation을 재개 할 수는 없었지만 chimeric DNA 중합효소 RNA의 primary sequence가 B형 간염 바이러스 생활사중 core particle의 형성에 영향을 미치는 결과는 이 바이러스 genome의 선천적 복합성을 시사하고 이 부분에 대한 앞으로의 연구가 필요하다는 것을 알 수 있었다.

목적: 만성간염 환자나 간암 환자에서 spliced RNA의 존재가 보고 되었지만 spliced RNA의 정확한 기능에 대해서는 잘 알려져 있지않다. 이 연구에서는 spliced RNA가 간암세포에서 B형 간염바이러스의 복제에 미치는 영향과 그 의미에 대해 알아보고자 하였으며 숙주세포에서 spliced 단백질과 세포골격 단백질간의 상호작용이 있는지 알아 보는 것이다. 재료 및 방법: HBV 중합효소 construct로부터 spliced RNA의 cDNA 클론을 얻어 splicing이 일어나는 construct를 제작하였고 이 때 B형 간염 바이러스 표면 단백질을 발현하지 않지만 splicing은 일어나는 construct를 제작 하였다. Spliced RNA효과와 단백질의 효과를 구별하기 위해 spliced 단백질 합성을 하지 못하는 construct를 각각 제작하였고 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소를 trans 혹은 cis로 제공하여 B형 간염바이러스의 복제가 가능하도록 구성물을 제공하는 construct의 조합을 제작하여 세포 내로 transfection하였다. RT-PCR, immunoprecipitation, immunofluorecence assay를 통해 모든 construct를 특성화 하였다. Spliced RNA의 발현이 B형 간염 바이러스 표면 단백질 secretion, core particle 형성, DNA 복제 그리고 B형 간염 바이러스 pg RNA level에 미치는 영향을 조사하였다. 결과: B형 간염 바이러스 DNA 중합효소만을 발현시킨 construct에서도 다양한 spliced RNA를 관찰하였다. 그 중 단백질로 발현되는 중합효소와 표면 fusion(PS fusion )단백질은 중합효소나 표면 단백질과는 명백히 그 분포가 달랐으며 glycosylation되어 있었고 ER (nuclear face 방향) 내에 위치하였다. 이 단백질은 숙주세포의 세포 골격인 vimentin과 microtubule에 함께 존재함을 확인하였다. PS fusion RNA는 표면 단백질의 분비를 억제하였으며 B형 간염 바이러스 복제 능력과 core particle 형성을 억제하였다. 이것은 세포 내에서 PS RNA로 인한 pg RNA의 감소 때문인 것으로 확인되었다. 결론: PS fusion RNA는 B형 간염 바이러스의 생활사 중에서 비교적 초기 단계인 pg RNA level을 감소시킴으로써 그 다음 단계인 core particle의 형성과 encapsidation 그리고 DNA 복제에 이르는 일련의 단계를 억제 할 수 있었다. 이는 B형 간염 바이러스 감염 시 숙주세포의 splicing machinery와 바이러스간의 상호 작용의 이해와 더 나아가 PS fusion RNA는 B형 간염 바이러스의 치료제로 응용될 수 있음을 제시한다. PS fusion 단백질발현과 숙주세포 골격과의 결합은 B형 간염 바이러스의 만성기전 연구에 기초를 제공할 것으로 생각된다.