caffeine에 의한 HGF-induced G2 delay 촉진효과 확인 및 기전분석

Abstract

In the present study, we explored the role of caffeine in G2 delay induced by HGF. Previously, we have shown that HGF induced transient G2 delay via ERK pathway. To address the involvement of ATM/ATR kinases in HGF-induced G2 delay, caffeine was used as an inhibitor. Interestingly, caffeine couldn't inhibit the HGF-induced G2 delay but rather augmented the HGF-induced delay while caffeine itself did not affect the duration of G2 phase significantly. Same observation was obtained by FACS analysis and mitotic index study. Increased G2 delay by caffeine was also accompanied with the delay in cdk1 activation and in cyclin B nuclear localization. Western blot analysis also showed delayed degradation of cyclin A and B. ATM/ATR knock-down cells did not show the augmentation of HGF-induced G2 delay, strongly suggesting that inhibitory activity of caffeine on ATM/ATR pathway was not related with increased G2 delay. Inhibitor study revealed that ERK pathway but not p38 MAPK, JNK, PI3K pathways, was involved in increased G2 delay. Western blot analysis revealed corroborating data with the inhibitor study. In caffeine and HGF co-treated cells, only ERK was more phosphorylated than in HGF treated cells. In addition, whether caffeine affects the duration of mitosis was addressed. Interestingly, caffeine itself could increase the mitosis duration, which was not influenced by HGF. In conclusion, we found that caffeine augmented HGF-induced G2 delay through ERK pathway.

세포성장인자가 G0/G1 phase외의 다른 세포주기에서 어떤 작용을 하는지 아직 잘 연구되어 있지 않은 상태이다. 우리 그룹에서는 실제로 성장인자 중의 하나인 간세포성장인자(HGF)가 G2 phase에서는 어떻게 영향을 주는지에 대해 연구하였고, 그 과정 중 G2 checkpoint 억제제로 알려져 있는 caffeine이 성장인자에 의해 나타나는 G2 checkpoint반응에 어떻게 작용을 하는지 알아보고자 하였다. Caffeine을 간세포 성장인자와 함께 처리했을 때, 성장인자에 의해 나타나는 지연현상이 없어질 것이라는 예상과는 달리 오히려 지연현상을 더욱 증가시키는 결과를 볼 수 있었다. Caffeine과 HGF를 처리했을 때 지연현상이 강화되었음을 FACS analysis와 mitotic index를 통해 확인하였고, 세포주기 중 G2 phase에서 mitosis로 진행될 때 중요한 요소인 cdk1 의 활성도는 어떻게 변하는지 알아보기 위해 cdk kinase assay를, cdk1의 활성을 조절하는 단백질의 변화를 보기위해 cyclin A, B에 대한 western blotting을 수행하였다. Caffeine과 HGF에 의해 증가된 지연현상이 mitosis에 중요한 cdk1의 활성도가 뒤늦게 나타남으로 인해 일어나는 현상이란 것을 확인할 수 있었고, cdk1 활성도만큼이나 중요한 cdk1/cyclin B의 핵으로의 위치도 뒤늦게 진행되는 것을 면역형광염색법을 통해 볼 수 있었다. Caffeine에 의해 증가된 지연현상의 원인이 무엇인지를 알아보기 위해 G2/M 진행에 중요한 pathway들을 siRNA와 inhibitor test, western blotting을 이용해 확인해 보았다. G2 checkpoint에 있어서 중요한 pathway에는 DNA손상과 관련된 ATM/ATR pathway외에 JNK, P38, PI3 kinase, ERK가 있는데, inhibitor test와 western blot을 통해 ERK pathway가 caffeine에 의한 증가된 지연현상과 가장 관련이 있는 것을 확인하였다. 실제로 caffeine과 HGF를 처리할 경우, HGF에 의한 ERK의 인산화를 더욱 증가시키는 것을 확인하였다. Caffeine은 또한 AKT의 인산화를 감소시켰는데, PI3 kinase 억제제인 LY294002와 HGF를 처리했을 때 caffeine과 HGF를 처리한 결과와 유사한 G2 지연현상을 관찰할 수 있었다. G2 phase외에 caffeine이 mitosis에는 어떠한 영향을 미치는지 알아본 결과 mitosis과정 중에는 caffeine자체만이 지연시키는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들을 봤을 때 caffeine이 PI3 kinase의 억제제로 작용하고, PI3 kinase가 억제됨으로 해서 ERK의 인산화가 증가되어 그 결과 G2 phase에서 지연현상이 일어나는 가설을 세우게 되었다. 실제로 이 가설을 확인하기 위해서 PI3 kinase와 ERK간에 연관성이 있는지 좀 더 연구해야 할 부분으로 남아있다.