The Effect of Mitochondrial Dynamics on Cell Cycle Progression

Abstract

Chromosome duplication and segregation is the most critical event during cell cycle progression and appears to be precisely controlled by several defined machineries. On the other hand, the mechanisms by which cellular organelles duplicate and partition into two daughter cells during cell division have been barely studied. Here, we investigated how mitochondria duplicate and partition during cell cycle progression. Using cell synchronization techniques, different phases of cells in cell cycle were collected and analyzed for the changes in mitochondrial DNA copy number and mitochondrial mass. We found that mitochondria mass gradually increased from G1 phase to mitotic phase and reduced back at the returning G1 phase. However, mtTFA, NRF-1, PRC, known as transcriptional factors regulating mitochondria biogenesis, did not significantly change during cell cycle progression. Interestingly, we found that heterogeneous mitochondrial population such as tubular network and fragmented small mitochondria found in interphase no longer exist in mitotic cells, suggesting that the mitochondrial reorganization may occur during G2 to M transition. When expression levels of hFis1, Mfn and Drp1 regulating mitochondrial fusion and fission were compared during cell cycle progression, we found that Mfn1 was specifically increased at G2 phase. Finally, we established the HeLa cell lines overexpressing hFis, Mfn or Drp1 genes, which accompanied with elongated or fragmented mitochondria. Interestingly, we observed that HeLa cells overexpressing the dominant-negative mutant of Drp1 gene showed delayed cell cycle progression, especially at G2/M phase. We are currently investigating whether the alteration in mitochondrial dynamics affects cell cycle progression in mammalian cells.

목적: 세포는 분열을 통해 모세포가 두개의 딸세포로 나누어지면서 균등하게 유전 물질을 배분한다. 그때 각각의 딸세포는 DNA와 더불어 미토콘드리아, centrosome, 소포체, 골지체 등과 같은 소기관들을 고르게 배분받아야 한다. 이 중 DNA의 분열 과정과 그 과정에 문제가 생겼을 때 그것을 인지하고 복구하는 체계에 대해서는 비교적 잘 알려져 있다. 그러나 세포 내 소기관들이 어떻게 두 개의 딸세포로 배분되는지는 지에 대해서는 아직 정확하게 밝혀져 있지 않다. 그 중에서 골지체가 세포 분열이 진행되는 동안에 소포체에 완전히 흡수되었다가 분열이 끝난 후 다시 재조합되는데, 이것이 저해될 경우 세포가 사멸한다는 내용이 보고 된바있다. 이러한 사실을 통해 세포가 분열을 할 때, 세포 내 소기관들의 분포 또한 일종의 점검 요소로 작용하고 있음을 예상할 수 있다. 본 연구에서는 미토콘드리아를 대상으로 첫째, 세포 분열 주기 동안 미토콘드리아 biogenesis의 변화를 알아보기 위해 미토콘드리아 DNA copy number의 변화, 미토콘드리아의 mass 변화, 미토콘드리아의 biogenesis를 조절하는 전사 인자들의 발현, 그리고 세포 분열 주기 동안 미토콘드리아의 형태 변화를 알아보았다. 둘째, 미토콘드리아의 형태 변화를 유도하였을 때 세포 분열 주기 진행에 어떠한 영향을 줄 것인가를 규명하고자 하였다. 재료 및 방법: HeLa 세포에서 세포 동일화 방법을 이용하여 세포 분열 주기 진행에 따른 미토콘드리아 mass를 미토콘드리아에 특이적으로 염색되는 MitoTracker와 NAO(10-nonylacridine orange) 형광물질로 염색하여 유세포분석법(FACS analysis)을 통해 알아보았다. 이때 미토콘드리아 DNA copy number를 real-time PCR을 통해 측정하였고, 또한 미토콘드리아의 biogenesis를 조절하는 인자들의 mRNA 발현정도를 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse-transcription PCR)을 통해 확인하였다. 미토콘드리아의 형태와 분포를 MitoTracker 형광물질을 염색하여 알아보았고, 세포 분열 주기 진행에 따라 미토콘드리아의 형태를 조절하는 단백질들의 발현을 western blotting을 통해 조사하였다. 미토콘드리아 형태 변화를 유도하였을 때 세포 분열 주기 진행에 어떠한 영향을 것인가를 알아보기 위해 미토콘드리아 분열(fission)과 융합(fusion)을 조절하는 인자들을 과 발현시켜 미토콘드리아 형태가 변화된 세포주를 제작하였고, 이 세포주에서 세포분열주기를 관찰하였다. 결과: 세포 분열 진행 과정 중 미토콘드리아의 mass는 G₁/S기에서 G₂기, M기로 가면서 2배로 증가했다가 다시 G₁기로 돌아오면서 감소하는 현상을 보였으며, mtDNA copy number는 G₁/S기에서 G₂기로 가면서 증가하지만 미토콘드리아 mass와는 달리 세포 분열을 마치고 다시 G₁기로 돌아와도 G₁/S기에 비해 상대적으로 높게 유지되는 것을 관찰하였다. 이때 미토콘드리아의 biogenesis를 조절하는 인자들인 mtTFA, NRF-1, PRC의 mRNA 발현에는 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 미토콘드리아의 형태를 관찰하던 중 interphase와 mitosis에서 미토콘드리아의 형태가 차이가 남을 알게 되었다. Interphase에서는 미토콘드리아가 연결 관상구조(interconnected tubular structure)를 이루고 있는데 비해 mitosis로 가면서 세포 골격구조가 변함에 따라 세포 형태가 변하게 되는데 미토콘드리아 형태 또한 재구성되어 연결 관상구조가 감소하고 막대기 형태(rod type)의 미토콘드리아가 현저하게 증가하는 현상을 관찰하였다. 그리고 interphase에서는 미토콘드리아의 연결 관상구조 이외에 미토콘드리아 길이가 3 ㎛미만의 작은 길이, 3-10 ㎛의 중간 길이, 10 ㎛이상의 긴 길이의 미토콘드리아 분포가 다양한데 비해서, mitosis에서는 3-10 ㎛의 중간 길이의 미토콘드리아가 76 %까지 증가하여 미토콘드리아 개체군이 동질성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 세포 분열이 진행되는 동안 미토콘드리아 형태를 조절하는 인자들의 단백질 발현정도를 알아보았는데 미토콘드리아의 분열(fission)을 조절하는 Drp1, hFis1의 단백질 발현정도는 차이를 나타내지 않았으나, 미토콘드리아의 융합(fusion)을 조절하는 Mfn1이 G₂ 시기에 유의하게 증가되는 현상을 관찰하였다. 또한 세포내에서 미토콘드리아의 분열을 조절하는 hFis1을 과 발현시킨 세포주와 분열을 억제하는 변이형 Drp1(Drp1^(K38A))을 과 발현시켜 미토콘드리아의 elongation을 유도한 세포주를 확립하였다. 이들 세포주의 세포 분열 주기를 조사하였을 때 미토콘드리아의 elongation이 유도된 세포주에서 G₂기에서 M기로의 전이가 지연되는 것을 관찰하였다. 결론: 본 연구에서는 세포 분열 주기 진행에 맞추어 미토콘드리아의 mass와 mtDNA copy number가 변하며, 미토콘드리아의 biogenesis를 조절하는 인자들에는 변화가 없다는 결과를 얻었다. 또한 interphase에서 나타나던 연결 관상구조가 mitosis로 가면서 감소하였고 미토콘드리아 개체군이 동질성을 나타냄을 알 수 있었다. 또한 세포내에서 미토콘드리아의 분열을 억제하여 elongation을 유도한 세포주에서 세포 분열 주기, 특히 G₂->M 전이가 지연되는 현상을 관찰하였다. 따라서 본 연구 결과로 첫째 세포 분열과 coupling되어 미토콘드리아 mass와 mtDNA copy number가 증가하며, 둘째 mitosis로 진행되면서 미토콘드리아의 형태의 재구성이 필요하다는 것을 알 수 있다. 셋째 이러한 미토콘드리아의 형태의 재구성을 억제하여 elongation을 과도하게 유도하였더니 세포 분열 주기 진행이 지연되는 것으로 보아 미토콘드리아 또한 일종의 점검 요소로 작용하고 있다는 증거로서 세포내에서 이를 인식하고 조절하는 장치의 연구가 앞으로 진행되어야 할 것이다.