RegulationofGap Junction Protein,Connexins in Immortalized Human Keratinocytes Cells(HaCaTcells)

Abstract

Intercellular communication for function of cells and tissues is very important as the intracellular communication system. Gap junctions are ordered arrays of intercellular plasma membrane channels that directly link the cytosols of two adjoining cells. Gap junctional intercelluar communication (GJIC) is an important mechanism controlling cellular homeostasis, proliferation, and differentiation. A family of gap junction proteins, the connexins(Cx), has been identified and comprises at least 20 members. Middle ear cholesteatoma is characterized by the presence of a squamous epithelium invading in the middle ear cavity, and is one of the most prevalent forms of otological diseases. The histologic features of cholesteatomas are similar to hyperproliferation and hyperkeratosis of the skin. The mechanism of intercellular communication in cholesteatomas remains unknown. Human middle ear cholesteatomas showed more increased expression of Cx43 and Cx26 than retroauricular skins. In another study for making in vitro 3 dimensional model of cholesteatomas, there was some difference of epithelial characteristics between a spontaneously immortalized epidermal cell line (HaCaT) and cultured cholesteatoma cells. If it is possible to control the intercellular communication system of cholesteatoma, in other words, if we inhibit the Cx expression of cholesteatoma, it will be able to inhibit the advancement of cholesteatoma. If we can increase the Cx expression in the in-vitro model that uses the HaCaT cells, we will be able to make a more useful in vitro model that is similar to the cholesteatoma. Under such hypotheses, the objectives of this study are to identify the expression of gap junction in HaCaT cells and to control the expression of gap junction proteins using various substances. From clinical point of view, easily applicable substances such as H₂O₂, acetic acid, dexamethasone, all-trans-retinoic acid(RA), and green tea extract epicatechin (EC) and epigallocatechin gallate(EGCG) were used for this study. These substances were first applied on the HaCaT cell line according to their concentration. After they were cultured for 24 hours, the cytotoxicity was analyzed by quantitatively assessing the degree of cell growth, and reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR). Western blot and immunocytochemistry staining were performed to analyze the change of Cx production and expression. In results, Cx26, Cx30, Cx43, and Cx31 in that order were expressed well in HaCaT cell line. After 24-hour culture, the substances that interfered the cell growth were acetic acid, H₂O₂, and 100 μM EGCG . Through RT-PCR, substances that up-regulated the expression Cx26 mRNA were 50 ㎍/㎖ EGCG, EC, and RA, and the substances that down-regulated Cx26 were acetic acid, H₂O₂, 5 and 100 ㎍/㎖ EGCG. In Western blot, 50 ㎍/㎖ EGCG up-regulated Cx26 protein, and acetic acid, H₂O₂, and dexamethasone down-regulated it, while 5ug/ml EGCG, EC, and RA showed little changes compared with the control. Immunocytochemistry of HaCaT cells showed decreased expression and abnormal location of Cx26 and Cx43 under acetic acid, H₂O₂, and 50 ㎍/㎖ EGCG. It also showed up-regulated or equal immunostaining of Cx26 and Cx43 under 5 ㎍/㎖ EGCG, EC, and RA and very similar staining in case of dexamethasone compairing with those in control. In conclusions, the gap junction proteins in HaCaT cells can be easily controlled by substances. From the results of this study, acetic acid and H₂O₂ are considered to be useful substances to inhibit the advancement of middle ear cholesteatomas, and RA, EC, and EGCG are thought to be useful when we are making in vitro cholesteatoma model using HaCaT cells.

정상적인 세포 및 조직의 기능을 위해서는 세포내 신호전달(intracellular communication) 뿐만 아니라 세포간 신호전달체계(intercellular communication)도 중요하다. 중이진주종은 정상적으로 있어야 할 편평상피세포가 여러 가지 원인으로 인하여 중이강 내에 위치한 것으로 상피조직의 과증식, 과분화, 과사멸 및 과각화 현상의 병리학적 특성을 보임으로써 청력소실 및 기타 이과적 합병증을 유발하는 흔한 중이질환이다. 진주종의 원인 규명을 위한 조직병리학적 특성 연구는 지금까지 많이 이루어져 왔는데, 대부분은 세포내 신호전달체계에 집중되어 있고, 세포간 신호전달 체계에 관련된 보고는 거의 없는 실정이다. 간극결합은 세포간 신호전달의 직접적인 통로로서 connexin(Cx) 단백이 주성분이다. 진주종의 Cx 발현에 관한 보고에 의하면 진주종 상피세포에서 Cx26, Cx43이 과발현 되어있는 것으로 알려져 있다. 한편 진주종 상피세포의 in vitro 3차원 모델 제작 실험에서 비교실험으로 사용하였던 HaCaT 세포주(immortalized human keratinocyte line)의 특성을 비교한 결과, 같은 각질세포이지만 여러 가지 단백 및 신호전달물질의 발현특성에 차이를 보이고 있다. 이에 진주종의 세포 간 신호전달체계를 조절할 수 있다면, 즉 Cx 발현을 억제하면 진주종의 진행을 억제할 수 있고, HaCaT 세포주를 이용한 in vitro 모델 실험에서 Cx의 발현을 증가시키면 진주종 상피세포와 유사한 in vitro 모델을 만들 수 있으리라 생각된다. 이러한 가설 하에 HaCaT 세포주에서의 간극결합의 발현을 확인하고, 여러 가지 물질을 이용하여 간극결합 단백, Cx의 발현을 조절하는 것이 본 연구의 목적이다. 본 연구에서는 HaCaT 세포주에서의 Cx 발현을 확인하고, 임상적으로 쉽게 적용할 수 있는 물질 H₂O₂, acetic acid(AA), dexamethasone, all-trans-retinoic acid(RA), 그리고 녹차 추출물인 epicatechin(EC), epigallocatechin gallate(EGCG)를 사용하였다. 우선 이들 물질을 HaCaT 세포주에 농도별로 적용하고 24시간 배양 후 세포증식 정도를 정량적으로 평가하여 세포독성을 분석하였으며, Cx 생성 및 발현의 변화를 역전사중합효소반응(RT-PCR), Western blot 및 면역세포화학 염색(immunocytochemistry)을 통해 분석하였다. 그 결과 HaCaT 세포주에서는 Cx 26, 30, 43, 31 순으로 발현이 잘되었으며, 24시간 약물을 사용한 후 세포의 성장을 방해하는 물질은 AA, H₂O₂, EGCG 100 ㎍/㎖이었다. 역전사중합효소반응을 통해서 Cx26을 촉진(up-regulation)하는 물질은 EGCG 50 ㎍/㎖, EC, RA 이었으며 억제(down-regulation)하는 물질은 AA, H₂O₂, EGCG 5, 100 ㎍/㎖이었고 Cx30, Cx43, Cx31도 유사한 양상이었다. Western blot에서 Cx26, CX30에서 촉진을 보인 경우는 EGCG 50 ㎍/㎖, 억제를 보인 경우는 AA, H₂O₂, dexamethasone, 대조군에 비해 큰 변화가 없는 경우는 EGCG 5 ㎍/㎖, EC, RA 이었다. 면역세포화학 염색으로 Cx 발현 및 세포막으로의 이동을 확인하였는데 이동이 잘 안되는 경우는 AA, EGCG 50 ㎍/㎖, H₂O₂ 였으며, Cx 발현이 증가한 경우는 EC, RA였고, dexamethasone, EGCG 5 ㎍/㎖는 대조군과 유사하였다. 정리하면 HaCaT cell의 Cx 발현을 억제하는 것은 AA, H₂O₂ 이며, 촉진하는 것은 EC, RA이며, EGCG는 농도에 따라 다르게 영향을 미쳤다. 결론적으로 HaCaT 세포주에서의 간극결합 단백은 Cx 26, 30, 43, 31이 발현되며, 이들 Cx의 발현은 발현조절물질을 통해서 조절이 가능하다. 본 연구의 결과를 이용하여 임상적으로 진주종 진행을 억제하는 물질로는 AA, H₂O₂가 유용할 것으로 판단되며, HaCaT 세포주를 이용한 in vitro 진주종 모델 제작시 RA, EC, EGCG가 유용할 것으로 생각한다.