Studies on Taxol Resistance Induced by HBx Viral Oncoprotein

Abstract

There is increasing evidence since the effective chemotherapeutic potential of taxol has been shown in a variety ofcancers such as ovarian,breast and lung.However,chemotherapy with taxol often fails due to resistance of hepatocellular carcinoma (HCC). I attempted to determine the effect of taxolon HCC.Infection with hepatitis B virus (HBV)is a high risk factor for the development of HCC.Hepatitis B virus X (HBx)protein encoded by HBV genome is likely to play a important role in development of HBV-related HCC In addition, I explored the role of HBx underlying resistance to taxol in HCC. Treatment with taxol(100nM and 1uM)led to induce celldeath in Chang cells. However, the degree of death in ChangX-34 and ChangX-31 such as HBx expressing cell was weak than Chang cells. Next,we examined levels of Bcl-2 phosphorylation, which are known as molecule related taxol-induecd death. The phosphorylation levels of Bcl-2 increased in Chang cells, whereas the phosphorylation of Bcl-2 was reduced in ChangX-34 and ChangX-31 cells compare to Chang cells. Also, we found that the phosphorylation and expression levels of Bcl-2 were important in taxol response of HBV-related hepatoma cell lines,which were established from primary HCC tumors. Taxol-induced celldeath in Chang cells was triggered by caspase-independent cell death pathways. In contrast, celldeath in ChangX-31 and ChangX-34 was occurred by caspase-dependent cell death pathways. In addition, we found sulfasalazine, inhibitor of NF-κB activation, significantly increased cell death in ChangX-31 and ChangX-34 in a caspase-dependent manner but had not in fluence on Chang cells. Therefore, we conclude that HBx play an important role in taxol-resistance in HBV-related hepatoma. On the other hand, we suggest that sulfasalazine may be useful in the therapy of HBV-related hepatoma.

목적: 간암은 다른 암에 비해 화학요법에 저항성을 보이는 것으로 보고되어 있지만, 그 기전에 관해서는 거의 알려진 바 없다. 우리나라 간암 발생의 중요 인자인 hepatitis B virus (HBV)는 감염 후 간경변을 거쳐 간암으로의 진행을 촉진하는데 이때 HBV의 바이러스성 단백질인 HBx (hepatitis B virus X protein)이 중요하게 관여하는 것으로 알려졌다. 본 논문에서는 유방암을 비롯하여 여러 종류의 암에서 항암효과가 알려진 taxol이 HBV 관련 간암 세포주 및 HBx를 발현하는 간세포주에 미치는 세포사멸 효과를 비교 조사하고, 이 현상을 매개하는 기전은 무엇인지를 분석함으로써 간암 세포가 항암제에 저항성을 갖게 되는 이유를 이해하고자 한다. 방법 및 재료: HBV 관련 간암 세포주와 HBx를 발현 간세포주에 taxol 100nM과 1μM를 24, 36, 48시간 처리하고 XTT assay를 통해 세포 생존율을 조사 비교하였다. 이런 현상이 taxol에 국한된 것이지 알아보기 위해 다른 microtubule 중합 억제제인 nocodazole 330nM과 1μM를 24, 48, 72시간 처리하고 XTT assay를 통해 세포 생존율을 관찰하였다. Taxol에 유도되는 세포사멸을 조절하는 인자들의 발현도를 조사하기 위해 p53, Bcl-2, caspase-3 등에 대한 western blot을 수행하였다. 또한, NF-κB의 억제제인 sulfasalazine이 HBx 발현 간세포에 미치는 세포 사멸 효과를 조사하였다. 결과: Chang 간세포주와 HBx를 발현하는 세포주인 ChangX-34와 ChangX-31에 taxol 저농도인 100nM과 고농도인 1μM을 처리하였을 때 Chang 세포에 비해 ChangX-34와 ChangX-31 세포의 생존율이 통계적으로 현저히 높게 관찰되었다 (**P<0.01, *P<0.05). 또한 동일한 세포주를 가지고 nocodazole 저농도인 330nM과 고농도인 1μM을 처리하였을 때도 HBx 발현 세포주에서 세포사멸이 현저하게 감소되었다 (**P<0.01, *P<0.05). HBx가 발현되는 세포가 taxol에 저항성을 보이는 이유를 알아보기 위해 taxol에 의해 활성이 조절된다고 알려진 세포내 인자들의 발현도를 확인하였다. 세포주기의 조절자인 p53과 p21의 발현을 알아본 결과, Chang 세포주에서는 taxol 100nM을 처리하였을 때, 36. 48시간에 p53과 p21의 과발현이 유도되는 한편 ChangX-34, ChangX-31 세포에서는 p53과 p21의 발현이 유도되지 않았다. Chang 세포에 taxol 처리 후 12, 24시간에 항 세포사멸 인자인 Bcl-2의 인산화가 유의하게 증가되었다가 36시간에 감소되는 현상을 관찰되었다. 반면, ChangX-34와 ChangX-31 세포에는 taxol 처리에 의한 Bcl-2의 인산화가 저해되는 것을 관찰하였다. 간암 환자의 암 조직으로부터 적출되어 확립된 간암 세포주인 SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-398, SNU-449, SNU-475 세포주들을 사용하여 taxol에 대한 세포사멸 효과를 비교하였다. SNU-387와 SNU-475 세포주은 taxol 처리에 의해 세포사멸이 유도되는 반면, SNU-398 와 SNU-449 세포주와 HBx의 mRNA가 발현되는 SNU-354 와 SNU-368 간세포주는 taxol에 의한 세포사멸 효과가 현저히 억제되었다 (**P<0.01, *P<0.05). 또한, SNU 간암 세포주에서 taxol에 의한 Bcl-2의 발현 양상을 조사한 결과, taxol에 대한 저항성을 보이는 간암 세포주에서 Bcl-2의 인산화가 유의하게 저해되는 것이 관찰되었다. 한편, Chang 세포주 및 간안 세포주에서 taxol에 의한 세포사멸은 procaspase-3 발현 저해에 유의한 변화를 동반하지 않음이 확인되었다. HBx를 발현하는 세포의 사멸을 유도할 수 방법으로 NF-kB 억제자인 sulfasalazine을 처리한 결과, HBx를 발현하는 세포에서 민감하게 세포 사멸이 유도되었다. 결론: HBV 관련 간암 세포주와 HBx 관련 세포주에서 taxol 처리에 의한 저항성을 보이는 세포주들이 관찰되었다. 흥미롭게도, taxol에 대한 저항성은 Bcl-2의 인산화와 상관성을 나타내었고, HBx의 발현이 Bcl-2의 인산화 저해에 직접적으로 관여될 가능성을 확인하였다. 또한, HBx 발현 세포주들은 sulfasalazine에 대해 민감하게 반응하여 세포사멸이 유도됨으로써, HBV 또는 HBx에 특이적 세포사멸 방안을 제시할 수 있는 근거를 제공하였다.