Identification of binding protein with kinesin18B

Abstract

Microtubules play an important role in intracellular transport of vesicles and organelles in higher eukaryotic cells. This transport depends on the activity of motor proteins that interact with microtubules. Most kinesins move cargoes outwards toward the cytoplasmic membrane. Members of the kinesin family have been implicated in vesicle and organelle transport, spindle and chromosome motility during meiosis and mitosis, microtubule destabilization, and flagellar and ciliary function. In the present study, we identified a protein that interacts with kinesin18B using a yeast two-hybrid system, GST pull-down assay, immunoprecipitation. This protein is Microtubule-associated protein RP/EB family member 1 containing a calponin homology(CH) domain at their N terminus and an EB1-like C-terminal motif at their C terminus : the functional importance of these domains has not been determined. Human EB1 family proteins, which include EB1, EBF3, and RP1, also associate with the tumor suppressor protein adenomatous polyposis coli(APC) and p150glued, a component of the dynactin complex. EB1 interacts with kinesin18B and has been localized to clusters near the distal ends of microtubules. Kinesin18B has been shown to move along microtubules and has been located at the plasma membrane and nuclear. The interaction between kinesin18B and EB1 may help to identify of function of kinesin18B.

목적: Kinesin은 microtubule의 plus end 방향으로 세포내 소기관을 실어 나르는 운동단백질이다. 현재 kinesin의 종류는 약 200가지 이상으로 알려져 있으며 각각 다른 cargo를 운반하며 세포내 소기관 수송 외에 세포내 신호전달, meiosis, mitosis등에도 역할을 하는 것으로 알려 져 있다. 본 논문에서 사용된 kinesin18B는 KIF(kinesin superfamily)의 motor부분에서 얻은 kinesin으로 mouse KIF18B의 motor 부분과 homology가 있어 임시로 kinesin18B라 이름을 붙였다. Kinesin18B의 세포내 위치를 확인한 결과 원형질막 부분의 몇 부분과 핵에 위치하고 있음을 알 수 있었다. Kinesin18B의 head부분 중 약 600bp를 없앤 후 세포내 위치를 확인해본 결과 원형질막에는 보이지 않고 핵에만 집중되어 있는 것을 알 수 있었고, 이 결과로 보아 head의 약 600bp되는 부분이 특별한 기능을 가지고 있을 거라고 예상되어 이 부분과 결합하는 세포 단백질을 분리하여 이 세포단백질과 kinesin18B의 결합을 확인하고 그 특성을 밝히고자 하였다. 재료 및 방법: Kinesin18B head 600bp부분과 결합하는 특정 단백질은 Yeast Two-Hybrid system을 이용하여 얻었다. Bait로 pGBT9/kinesin18B(654-842)를 사용하였고 prey로 pACT2/HeLa library를 사용 하였다. β- galactosidase filter assay를 실행 하여 가능성 있는 콜로니를 얻었고 이 콜로니들이 갖고 있는 pGBT9 vector에 있는 콜로니를 가려내기 위해 선별작업을 하였다. 선별작업 후 pACT2vector에 실려있을 콜로니에서 DNA를 얻었으며 restriction enzyme digestion으로 insert를 확인하였다. Insert 확인 후 sequencing을 하였고 그 결과를 NCBI site에서 homology search를 하였다. 그 결과 중 kinesin과 연관이 있을 가능성이 큰 protein을 정해 확실한 결합여부를 알기 위하여 positive control과 함께 다시 Yeast Two-Hybrid system을 시행 하였으며 그 후 GST Pull-down과 Immunoprecipitation을 실행 하였다. 결과: Yeast Two-Hybrid system을 수행 하고 β-galactosidase filter assay를 한 결과 가능성이 보이는 43개의 파란색 콜로니를 얻었다. 그 콜로니들에서 DNA를 얻어 enzyme digestion으로 확실한 insert확인을 하여 26개를 얻게 되었다. 26개의 DNA를 sequencing을 하고 그 결과를 NCBI에서 homology search를 하였다. 그 결과로 8종류, 26개의 DNA를 얻었으며 그 중 Microtubule - associated protein RP/EB family member 1(이하 EB1)을 중심으로 kinesin18B와의 결합여부를 재확인 하게 되었다. Yeast Two-Hybrid system으로 재확인을 한 결과 파란색 콜로니로 결합 여부를 확인할 수 있었으며 positive control도 파란색 콜로니를 띄었고 pGBT9/18B(654-842)와 pACT2vector, pGBT9vector와 pACT2/EB1, pACT2vector와 pGBT9vector는 각각 하얀색 콜로니를 띄고 있음을 확인하였다. GST Pull-down과 IP에서도 각각 in vitro와 in vivo interaction을 확인할 수 있었다. 결론: Kinesin18B(654-842)와 EB1, Kinesin18B와 EB1의 결합여부가 in vitro에서 확인이 되었으며 나아가 in vivo 상태에서도 확인이 되었다. 그리고 kinesin18B ORF와 EB1 ORF의 결합여부도 in vivo상태에서 확인이 되었다.