Molecular mechanism and roles of dCLOCK regulation in Drosophila circadian clock

Abstract

Circadian clocks adapt to daily environmental changes and produce physiological and behavioral rhythms of approximately 24 h in most living organisms. The common molecular mechanism is the involvement of transcriptional/translational feedback loops (TTFL), which are well conserved in various organisms. The rate-limiting component, CLOCK, is a core transcription factor and essential for the rhythmic expression of the core clock genes. In Drosophila, CLOCK (dCLK) forms a heterodimer with CYCLE (CYC) and transcribes period (per) and timeless (tim) genes and other core clock genes. Newly translated PERIOD (PER) proteins translocate into the nucleus and physically interact with the dCLK/CYC complex to inhibit the transcriptional activity of dCLK/CYC, forming a negative feedback loop. Thus, the activation and repression of CLOCK transcriptional activity by rhythmic interaction among activators and repressors is central to the maintenance of circadian rhythms. In addition to transcriptional regulation, posttranslational regulation, mainly phosphorylation of clock proteins, also plays a crucial role in fine-tuning the 24-h cycle of molecular oscillators. dCLK undergoes daily changes in phosphorylation states: for example, hypo-to-medium phosphorylated isoforms present during mid-day/early night, and medium-to-hyper phosphorylated isoforms present during late night/early day. Mostly, “medium” phosphorylated isoforms of dCLK are observed throughout the day. Previous reports showed that hyper-phosphorylated dCLK by DOUBLETIME (DBT), a homolog of casein kinase Iε, promotes the degradation of dCLK. However, the function of ”medium” phosphorylation of dCLK is unclear at the organismal level. Therefore, a key understanding of how CLOCK regulates the molecular oscillator is important in the circadian pacemaker. To further understand the CLOCK-controlled mechanism in Drosophila, I researched three main aspects in this study. First, to understand how dCLK regulates transcriptional activity, based on the concept that PER physically interacts with dCLK to repress dCLK activity, I initially sought to identify the region in dCLK required for the interaction with PER, a core repressor. I used co-immunoprecipitation with internal deletion dCLK variants and PER in Drosophila S2 cell lines. I identified that amino acids (AA) 657-707 of dCLK, a mouse CLK exon 19 homologous region, which is deleted in Clk/Clk mutant mice, are required for PER interaction in both S2 and HEK293 cells: however, it is not a direct PER-binding domain. dCLK internally deleted from AA657-707, named dCLK-, has attenuated E-box-dependent transcriptional activity in S2 cells. Consistent with this, in transgenic flies expressing dCLK lacking AA657-707 in the Clk null genetic background (termed p{dClk-}:Clkout), the peak level and amplitude of core clock gene mRNA rhythms were lower than those in control flies. Behaviorally, p{dClk-}:Clkout flies manifested arrhythmic locomotor behavior with no anticipatory activities during photic entrainment. At the molecular level in clock cells, an unexpected pacemaker neuron-specific disturbance of the molecular clockwork was observed. The amplitude of dCLK target proteins significantly dampened in photosensitive neurons, such as ventral lateral neurons (LNvs), while the dCLK target protein cycling was robust in dorsal lateral neurons (LNds) and dorsal neurons (DNs) under light entrainment condition. The alterations of molecular oscillators in LNvs might explain the arrhythmic locomotor behavior rhythms during photic entrainment. Therefore, dCLK AA657-707 plays an important role in both PER interaction and transcriptional activity and is necessary for LNvs-specific transcriptional activation, thereby, regulating photic induced behavior activity. Second, to understand the global physiological roles of dCLK phosphorylation at the organismal level, I initially identified multiple phosphorylation sites on dCLK from Drosophila S2 culture cells by using mass spectrometry. The results in S2 cells showed that global phosphorylation of dCLK decreases its stability and transactivation potential. Transgenic flies expressing the dCLK mutant version, wherein 15 identified serine residues switched to alanine in the Clk null genetic background (termed p{dClk-15A}:Clkout), show behavioral rhythms with a 1.5-h shorter period during photic entrainment. In flies, dCLK-15A protein is hypo-phosphorylated and exclusively abundant, which could explain the faster pace of the clock. The daily peak levels in per/tim mRNA and protein reached higher values in dCLK-15A mutant flies, further supporting the notion that dCLK levels are rate-limiting in the clock mechanism. Consistently, the amplitude of dCLK target protein in pacemaker neurons increased with an advanced phase in photic entrainment condition, and it was highly correlated with a shorter period. Therefore, global phosphorylation is essential for dCLK stability, and transactivation potential, ultimately, plays a crucial role in setting the pace of the clock. Finally, from the surprising results that p{dClk-}:Clkout flies showed robust oscillation in temperature-sensitive neurons, such as in DNs and not in LNvs, although the flies have low dCLK-mediated transcription activity, I focused on dCLK regulation in temperature entrainment condition. In p{dClk-}:Clkout flies, anticipatory activities before temperature transition were observed in temperature cycles, unlikely in light/dark cycles. Importantly, although the amplitude of molecular oscillator in LNvs greatly reduced, the amplitude of molecular rhythms in temperature-sensitive neurons, such as DNs, was robust with a delayed phase, which is correlated with delayed anticipatory activity in temperature cycles. Thus, p{dClk-}:Clkout flies manifest improved locomotor activity in temperature entrainment condition, which is likely due to robust molecular oscillations in temperature-sensitive neurons such as DNs. On the contrary, in p{dClk-15A}:Clkout flies, the daily activity rhythms failed to maintain synchronization to temperature cycles under constant darkness, although there was no observable impairment in aligning to light/dark cycles. More importantly, pacemaker neuron-specific disturbance of the molecular clockwork was also observed in p{dClk-15A}:Clkout flies. The amplitude of dCLK target proteins significantly dampened specifically in DNs, but not in LNvs and LNds, in temperature cycles. Therefore, blocking multiple phosphorylations of dCLK or high levels of dCLK-induced DN-specific disturbance of the molecular clockwork leads to impaired temperature-induced behavior in locomotor activity. Taken together, the results from two different CLOCK mutants suggest that the dCLK/CYC-dependent machinery operates differentially in a subset of pacemaker neurons, which may contribute to specific roles, such as differential sensitivity to entraining cues. Further studies will be required to understand the molecular mechanisms of dCLK regulation in temperature condition further and explore how dCLK/CYC-dependent machinery works differently in cell type- or tissue-specific manner. In conclusion, first, dCLK AA657-707, a mouse dCLK exon 19 homologous region, is required for PER interaction and transactivation potential. It also contributes to photic induced behavioral locomotor rhythms. Second, global phosphorylation of dCLK is crucial for maintaining dCLK abundance properly, playing a critical role in setting the pace of the clock. Finally, pacemaker neuron-specific alterations by two different dCLK mutants suggests that dCLK regulation plays a crucial role in governing circadian entrainment by adjusting the circadian gene expression in a pacemaker neuron-dependent manner.

생체시계는 외부의 환경에 대해 적응하고 이를 예측 하는 시스템으로 살아있는 모든 생명체가 가지고 있다. 이 생체시계는 세포수준에서도 작동하는데 Transcriptional Translational Feedback Loop (TTFL)은 생체리듬의 주기가 24시간을 유지하는데 중요한 기전이다. 초파리의 생체시계에서 CLOCK (dCLK)은 핵심 전사인자로 period (per)와 timeless (tim) 등의 생체시계의 주요 유전자들의 발현을 촉진하고, 만들어진 PERIOD (PER)와 TIMELESS (TIM)의 단백질은 다시 핵으로 들어와 dCLK의 전사활성을 억제시킴으로써 음성 되먹임 고리를 형성한다. 이렇듯, 초파리의 PER와 dCLK과 같은 activator와 repressor 간의 물리적 상호 작용은 생체시계 주요 유전자가 24시간을 주기로 규칙적인 발현하는데 중요하다. 또한, dCLK은 하룻동안 인산화 정도가 규칙적으로 변화하는데, 늦은 밤과 이른 아침에는 dCLK이 medium-인산화 상태에서 hyper-인산화 상태로 변하고, 낮 시간 동안에는 hypo-인산화 상태에서 medium-인산화 상태로 변한다. 흥미롭게도, dCLK의 medium-인산화 상태는 하룻동안 항상 관찰되지만, 왜 dCLK이 항상 어느 정도 수준의 인산화가 일어나고, 생리 기능은 무엇인지는 유기체 수준에서 밝혀지지 않았다. 따라서, 초파리의 생체시계서 dCLK의 조절하는 메커니즘 및 기능연구를 세 부분으로 나누어 수행했다. dCLK의 전사활성이 어떻게 조절하는지 이해하기 위해 dCLK의 활성을 억제하는 PER가 dCLK의 어느 부위에 상호작용하는지 찾았다. dCLK의 amino acids (AA) 657-707은 마우스 CLK (mCLK)의 엑손 19 부분과 상동하는 부분인데, 초파리 S2 세포와 초파리에서 모두 PER와 상호작용에 필요하다는 것을 입증했다. mCLK 또한 HEK293 세포에서 mPER 상호 작용에 필수적이며, 이는 CLK 및 PER과의 상호 작용의 생화학 적 특징이 파리와 포유류에서 보존됨을 암시한다. 또한, S2 세포에서 dCLKΔ AA657-707 (dCLKΔ)은 E-box에 의존적인 전사활성이 현저하게 감소함으로써, AA657-707 부위가 PER 단백질과 결합뿐 만 아니라 dCLK 단백질의 전사활성에도 필요한 부분임을 의미한다. In vivo 수준에서 dCLK AA657-707의 기능을 연구하기 위해, CLK이 발현하지 않는 Clk null (Clkout)에서 dCLKΔ 을 발현시킨 형질전화 초파리 (p{dClk-Δ}:Clkout)를 제작하여 행동학적∙ 분자적 리듬을 관찰했다. S2 세포의 결과와 일관되게, p{dClk-Δ}:Clkout 초파리의 dCLK 타깃 유전자들의 mRNA 진폭이 대조군 초파리에 비해 상당히 낮은 것으로 보아, 초파리에서도 전사활성이 낮은 것으로 생각된다. 또한, 초파리에서 dCLK-Δ 단백질은 과인산화가 거의 일어나지 않고 양이 많은데, 이것은 PER 단백질과 결합이 약하기 때문인 것으로 보인다. 행동학적으로, p{dClk-Δ}:Clkout 초파리는 빛/어둠(LD)을 규칙적으로 적응시킨 환경에서 생체리듬을 전혀 만들지 못했다. 흥미롭게도, p{dClk-Δ}:Clkout 초파리는 LD 상황에서 생체리듬을 내는데 중요한 생체시계 뉴런 중 하나인 ventral lateral 뉴런 (LNvs)에서만 특이적으로 생체시계 주요 단백질들의 발현이 낮은 것을 관찰했다. 따라서, LNvs 세포에서의 분자시계 (oscillator)의 결함으로 인해 LD상황에서 초파리의 리듬이 망가진 것을 유추할 수 있다. 따라서, dCLK의 AA657-707은 S2 세포와 파리에서 PER 상호 작용과 전사 활성을 위해 필요하다. 또한, 이러한 생화학적 기능은 포유류에서 보존 될 수 있다. 게다가, dCLK AA657-707 부위는 LNvs 세포 특이적으로 분자 시계에 영향을 주어 빛에 의해 유도되는 초파리의 행동 리듬 양상을 조절한다. 둘째, dCLK 단백질의 global한 인산화 역할을 연구하기 위해, S2 세포 배양 세포에서 질량 분석을 통해 dCLK의 14 개의 인산화 부위들을 찾았다. 찾은 인산화 부위를 모두 알라닌으로 치환하여 인산화가 되지 않도록 제작한 dCLK 단백질 (dCLK-15A)의 E-box 의존성 전사활성이 대조군에 비해 2배 정도 높은 것을 관찰함으로써, dCLK 단백질의 global 인산화가 전사활성을 줄이는 것을 밝혔다. 또한, p{dClk-15A}:Clkout 초파리의 dCLK-15A 단백질 역시 인산화가 거의 일어나지 않고, dCLK 단백질의 양도 많았다. 즉, dCLK 의 글로벌한 인산화는 dCLK 단백질의 양을 줄이면서 stability에 중요한 역할을 한다. 행동학적으로 p{dClk-15A}:Clkout 초파리는 LD 상황에서 생체리듬의 주기가 짧아졌는데, 이것은 dCLK-15A 단백질의 양이 많아지면서 분자 시계의 진폭이 높아졌기 때문이라 생각된다. 따라서, dCLK 의 글로벌한 인산화는 dCLK 단백질의 양을 줄임으로써 dCLK 단백질의 stability에 결정적인 역할을 하며, 궁극적으로 생체시계의 속도를 정확히 조절하는데 중요한 역할을 한다. 마지막으로, 온도 동반 상황에서, 두 가지 dCLK 변형 초파리에서 모두 놀라운 행동∙분자 수준의 표현형을 발견했다. p{dClk-Δ}:Clkout 초파리는 LD 상황과는 다르게 온도 동반 상황에서 행동 리듬이 향상되었고, activity peak는 지연되었다. 이는 dorsal neurons (DNs) 뉴런과 같은 온도에 민감한 세포에서 지연된 phase를 가지고 강한 리듬을 보이는 분자리듬과 일치한다. 따라서, dCLK AA657-707은 DNs 세포의 분자시계보다 LNvs 세포의 분자시계에 더 강하게 영향을 주면서 외부환경에 따라 다른 행동리듬 양상을 보인다. 반대로, p{dClk-15A}:Clkout 초파리는 LNvs 세포가 아닌 DNs 세포에서 특이적으로 분자시계의 교란을 수반하여 온도 동반 상황에서 행동 리듬이 망가짐을 확인했다. 따라서, dCLK의 global한 인산화/ 또는 dCLK의 stability는 온도에 민감한 DNs 세포에 더 영향을 줌으로써 온도 induced 행동 리듬 양상에 결정적인 영향을 미친다. 서로 다른 2가지 dCLK 변형 초파리 결과를 바탕으로 동일한 분자 구성 요소로임에도 불구하고 분자시계가 조직 특이적으로 다르게 작동할 수 있다는 사실을 유추할 수 있다. 본 연구는 인산화를 비롯한 dCLK 조절이 dCLK 전사활성, 안정성 및 PER와 의 상호 작용을 통해 어떻게 dCLK 단백질이 생체시계를 작동하는데 영향을 미치는지 깊이 이해할 수 있다. 또한, dCLK 단백질의 조절은 환경 변화에 대해 적응하는데 중요한 역할을 한다. 따라서, dCLK 단백질에 기반한 분자시계 기전을 연구함으로써, 생체시계 조절의 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 뿐만 아니라, pacemaker neurons에서 분자시계 기전이 다르게 작동하는 것이 외부환경의 변화에 대해 다른 민감성을 가지고 특정 역할을 하는 것에 기여할 것이라는 새로운 관점을 제시했다.