Effects of dihydrophaseic acid 3ʹ-O-β-D-glucopyranoside isolated from Lycii radicis cortex on osteoblast differentiation

Abstract

Ethanol extract of Lycii radicis cortex (LRC) prevented the loss of bone mineral density in ovariectomized mice by promoting the differentiation of osteoblast linage cells. In this study, I performed fractionation and isolation of the bioactive compound(s) responsible for the bone formation–enhancing effect of LRC extract. A known sesquiterpene glucoside, (1ʹR,3ʹS,5ʹR,8ʹS,2Z,4E)-dihydrophaseic acid 3ʹ-O-β-D-glucopyranoside (abbreviated as DPA3G), was isolated and identified as a candidate constituent. I investigated the effects of DPA3G on osteoblast and osteoclast differentiation, which play fundamental roles in bone formation and bone resorption, respectively, in bone remodeling. The DPA3G fraction treatment in mesenchymal stem cell line C3H10T1/2 and preosteoblast cell line MC3T3-E1 significantly enhanced cell proliferation and alkaline phosphatase activity in both cell lines compared to the untreated control cells. Furthermore, DPA3G significantly increased mineralized nodule formation and the mRNA expression of osteoblastogenesis markers, Alpl, Runx2, and Bglap, in MC3T3-E1 cells. The DPA3G treatment, however, did not influence osteoclast differentiation in primary-cultured monocytes of mouse bone marrow. Because osteoblastic and osteoclastic precursor cells coexist in vivo, I tested the DPA3G effects under the co-culture condition of MC3T3-E1 cells and monocytes. Remarkably, DPA3G enhanced not only osteoblast differentiation of MC3T3-El cells but also osteoclast differentiation of monocytes, indicating that DPA3G plays a role in the maintenance of the normal bone remodeling balance.

선행 연구에서 지골피 추출물(Lycii radicis cortex)이 조골세포의 분화를 촉진하고 난소를 절제한 골다공증 모델마우스의 골밀도 감소를 억제한다는 것을 발견하였다. 본 연구는 지골피 추출물에서 조골세포의 분화를 촉진하는 효능성분(bioactive compound)을 분리·동정하고 그 효과를 조사하는 연구를 수행하였다. 70% 에탄올 지골피 추출물에서 다양한 용매를 사용한 분획과 양성자핵자기공명 (1H-NMR), 탄소핵자기공명 (13C-NMR), 질량스펙트럼 방법을 통한 분획물의 분석을 통해 조골세포 분화 촉진 효능성분으로 (1ʹR,3ʹS,5ʹR,8ʹS,2Z,4E)-dihydrophaseic acid 3ʹ-O-β-D-glucopyranoside(DPA3G)를 동정하였다. DPA3G가 골 형성(bone formation)에 관여하는 조골세포(ososteobla)의 분화와 골 흡수(bone resorption)에 관여하는 파골세포(osteoclast) 분화에 미치는 영향을 각각 연구하였다. 조골세포의 전구세포인 중간엽 줄기세포주 C3H10T1 / 2 와 조골모세포주 MC3T3-E1에서 DPA3G 분획을 처리하여 세포의 증식 및 알칼리성 포스파타아제 활성(alkaline phosphatase)을 분석한 결과, DPA3G가 조골세포의 세포증식과 분화 증가에 유의한 효과가 있었으며, MC3T3-E1 세포의 석회화 결절형성(mineralized nodule formation)과 조골세포 분화의 유전적 마커인 Alpl, Runx2 및 Bglap의 mRNA 발현을 크게 증가시켰다. 한편, DPA3G는 마우스 골수에서 분리·배양한 초대배양 단핵세포(primary monocyte)의 파골세포 분화에는 영향을 미치지 않았다. 생체 내에서는 조골세포와 파골세포가 공존하여 뼈 리모델링을 조절하기 때문에, 조골세포 전구체인 MC3T3-E1 세포와 파골세포 전구체인 초대배양 단핵세포의 공배양(co-culture) 조건하에서 DPA3G 효과를 실험 하였다. DPA3G 처리에 의해 MC3T3-E1 세포의 조골세포로의 분화뿐만 아니라 단핵세포의 파골세포로의 분화도 함께 증가되었다. 특히, 공배양에서 파골세포의 분화촉진에 필요한 RANKL의 발현 증가가 확인 되었다. 이는 DPA3G에 의한 조골세포의 분화 촉진으로 RANKL의 분비가 증가되고, RANKL에 의해 파골세포의 분화가 촉진 됨으로써 전체적인 뼈 리모델링이 촉진되었을 가능성을 시사한다. 이러한 결과로부터, DPA3G가 정상적인 뼈 리모델링의 균형 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.