Screening and Functional Study of the Genes inducing Malignant Degeneration of Neurofibromatosis Type 1

Abstract

Neurofibromatosis type 1(NF1) is one of the most common inherited autosomal dominant disorders, with an estimated incidence of 1 per 3,500 births. NF1 is caused by mutations in the NF1 gene which consists of 57 exons and encodes a GTPase activating protein(G AP), neurofibromin. NF1 is clinically characterized by cafe-au-lait(CAL) spots, neurofibromas, freckling of the axillary or inguinal region, Lisch nodules, optic nerve glioma, and bone dysplasias. NF1 is notable for the existence of a gradual malignant degeneration of normal and/or benign tumor cells. Three pathological phenotypes of fibroblast cells, normal, benign and malignant, are exist within an individual despite they bare an identical germ line mutation. The influence of tumor-related genes such as TP53, NK4, and ARF, and the impact of stochastic events have been suggested as causes of this variability. However, there has been no clear evidence to clarify the cell-fate decision factor in NF1. For whole gene expression comparison among normal fibroblasts, benign and malignant tumor cells, we used ACP(annealing controlled primer) based PCR method, GeneFishing DEG(differentially expressed gene) screening, which substantially improves the specificity and sensitivity of PCR and eliminates the false positives and poor reproducibility of previous DEG discovery methods such as cDNA microarray. In this study, we compared mRNA expression levels among cultured cells from the pathologically normal, benign, and malignant tissues of a Korean patient with NF1. Using 120 sets of ACP primers, we found total 64 DEGs that include 37 DEGs showing up-regulation in malignant cells and 27 DEGs showing down-regulation in malignant cells. To confirm the existence of genetic alterations in NF1 tumor cells, we carried out CGH(comparative genomic hybridization) array in NF1 cells, but no genetic alterations have been found in the NF1 cells. We have cloned and sequenced 20 DEGs that showed clear differences in expression pattern among cell types. We performed a validation study on the 8 DEGs by RT-PCR using gene-specific primers and then by Western blot analysis. Finally we selected 3 genes, TAGLN, SERPINE1, and IFITM1, as the key gene(s) involved in malignant degeneration of NF1 in this patient. Two genes, TAGLN and SERPINE1, showed up-regulation of expression in the tumor cells, while IFITM1 showed down-regulation of expression in the tumor cells. In order to clarify the cellular functions of theses 3 genes in the malignant NF1 cells, we have used RNA interference(RNAi) for inhibition of gene expression, and vector-mediated gene expression for induction of gene expression. Proliferation rate of the malignant NF1 cells was reduced by RNAi for both TAGLN and SERPINE1 genes and by over-expression of IFITM1. Finally, mitochondria fragmentation and cell death was observed in the malignant NF1 cells, by over-expression of IFITM1. A further functional analysis of them may lead to a better understanding the mechanisms of tumoregenesis and malignant degeneration of NF1.

신경섬유종증 제1형(neurofibromatosis type1, NF1)은 다기관의 신경계에 종양을 형성하는 우성 유전질환으로 높은 발병률, 예측이 불가능한 합병증의 동반과 악성화, 임상적 증상의 다양성과 심각성, 외과적 수술이외의 치료방법의 부재 등으로 효과적이고 근본적인 치료법에 대한 기초적 연구가 절실히 요구되고 있으나 현재 국내에는 NF1에 대한 연구가 매우 미비한 실정이다. NF1은 NF1 유전자의 돌연변이가 원인이 되어 그 산물인 neurofibromin의 결핍에 의한 Ras 단백질의 과잉활성에 의해 발병한다는 기전이 밝혀져 있다. 동일한 NF1 환자의 동일한 유전형을 가진 같은 종류의 세포에서도 정상, 양성, 악성으로 다르게 변화하기 때문에 조직의 악성화에 관여하는 유전자가 존재할 것이라 생각된다. 본 연구에서는, 발현량 또는 발현양상의 차이에 의해 조직 및 세포 특이적으로 다양한 임상증상에 관여하는 특정의 유전자를 동정하고, 그 유전자의 NF1 악성화에 관여하는 기전을 규명하는 것을 연구의 목표로 하였다. 한명의 NF1 환자 유래의 정상세포, 양성종양세포, 악성종양세포를 실험재료로 사용하여, ACP(annealing control primer) based PCR method, GeneFishing DEG(differentially expressed gene) screening을 사용하여 각 세포간의 발현양상을 체계적으로 비교·분석하여, NF1의 악성화에 관여하는 유전자를 발굴·동정하였다. DEG screening 결과에서 64개의 DEGs를 발굴하였으며, 발굴된 유전자중에서 8개의 유전자를 선정하여 RT-PCR과 Western blotting을 통해 mRNA 및 단백질 수준에서 발현량의 차이를 확인하였다. 그 결과 최종적으로 악성화 된 NF1 세포에서 발현량이 증가하는 2개의 유전자 TAGLN과 SERPINE1을, 감소하는 1개의 유전자 IFITM1을 NF1의 악성화에 관여하는 candidate gene으로 선정하였다. DEG screening의 정확성을 제고하기 위하여 comparative genomic hybridization(CGH) array 방법을 사용하여 whole genome 상에서 특정 유전자의 증폭과 소실 유무 등의 유전적 변이(genetic alteration)가 있는지 비교·분석한 결과, NF1 환자 유래의 정상세포, 양성종양세포, 악성종양세포 모두에서 로 특정 유전자의 소실이나 변이를 발견할 수 없었다. RNA 간섭(RNA interference, RNAi)에 의한 TAGLN과 SERPINE1 유전자의 발현억제와, 과발현(over-expression)에 의한 IFITM1 유전자의 발현증가의 인위적 발현조절방법을 악성화 된 NF1세포에 적용하여, NF1의 악성화에 이들 유전자들이 어떻게 관여하는지 기능규명(functional study)을 실시하였다. TAGLN과 SERPINE1에 대한 RNAi 적용과 IFITM1의 over-expression의 모든 경우에서, NF1 malignant cell의 증식률(proliferation rate)이 감소되었다. 특히, IFITM1의 over-expression의 경우 양성 및 악성 NF1 cell 모두에서 mitochondria의 fragmentation을 유도 하였으나, 악성세포 특이적인 cell death를 확인 하였다. 본 연구결과가 NF1의 악성화 기전규명에 도움이 되기를 기대한다.