Identification and Analysis of Peanut and Soybean Cross Reacting Allergens in Korean Children Sensitive to Peanut

Abstract

BACKGROUND: Peanut and soybean are among the most prevalent allergens of food hypersensitivity. They both belong to legume family and share high similarity in many parts of their seed storage proteins. the clinical manifestations of allergy to peanut and soybean are generally quiet distinct. And also, there are many cases of allergic patients with high level of soybean-IgE without clinical soybean allergy, especially in patients with high level of peanut-IgE. OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate the IgE binding proteins in both species, with a goal of identifying homologous epitopes of peanut and soybean protein that can potentially elicit serious allergic reactions. METHODS: Sera were obtained from 17 patients with high levels of peanuts and soybean specific IgE antibodies by ImmunoCAP(Pharmacia Diagnostics). Unabsorbed sera and sera adsorbed to remove cross-reacting antibodies were assayed for specific IgE binding to peanut or soybean immunoblots. SDS-PAGE and peanut-IgE immunoblotting with soybean-inhibited peanut allergy patient sera and non inhibited patient sera were performed. The spot membrane containing the peptides was analysed by Procise 492 cLC Protein sequencer (Applied Biosystem, Foster City, CA). Peptide synthesis of predicted Peanut-Soy common IgE binding epitopes were performed and then predicted epitope IgE ELISA to peanut hypersensitive patient's sera were performed. RESULTS: IgE inhibition ELISA test using peanut sensitized sera showed significant inhibitions by soybean protein at 800ug concentration. Using the ELISA inhibition test, there are some degree(25.15%) of cross reactivity between epitope #1 and soybean antigens was noted. The results of IgE inhibition immunoblot with peanut hypersensitive patients' sera inhibited to soybean glycinin disappeared several protein bands, especially two bands was prominent(38 kDa, 23 kDa). A search for sequence homology to the protein spots revealed that significant homology to peanut Ara h 3. CONCLUSION: This study has identified a common IgE-binding epitope site present with the peanut Ara h 3(38 kDa, 23 kDa) and soybean glycinin proteins. This site could contribute to the cross-reactions observed in sera between peanut- and soybean-sensitive individuals.

배경: 땅콩과 대두는 같은 콩과식물에 속하는 주요 알레르기 식품으로, 외국의 경우 최근 땅콩의 주요 알레르겐인 Ara h 3와 대두의 glycinin이 IgE와 결합한 epitope을 공유한다는 보고들이 있다. 또한 우리나라 환자들 중에도 혈청검사를 시행해 보면, 땅콩과 대두 단백에 대한 특이 IgE치가 동시에 높은 환자들이 흔히 발견된다. 목적: 연구자들은 땅콩 특이 IgE가 높은 환자 혈청을 이용하여 western blot inhibition test와 아미노산 염기서열분석을 통하여 땅콩과 대두의 교차 알레르겐을 동정하고, 동정된 알레르겐으로부터 IgE와 결합한 epitope을 규명함으로서 추후 임상 및 기초 연구에 이용하고자 본 연구를 시행하였다. 재료 및 방법: 국내산 땅콩 조항원을 pI값에 따라 분리한 후, SDS-PAGE를 수행하여 분자량을 기준으로 다시 분리하였다. 분리된 땅콩항원을 국내산 대두항원으로 inhibition한 땅콩 알레르기 환자의 혈청을 이용하여 western blot inhibition test를 시행하였고, 동시에 양성 대조 blot은 대두항원을 억제를 시행하지 않은 혈청으로 시행하였다. 그리고 각각의 blot을 비교하여 반응이 억제된 단백 분획을 분리하여 N-terminal amino acid sequencing을 수행하였다. 여기서 얻은 아미노산 서열 결과를 protein database에 넣어서 해당 단백을 동정하였다. 이 후 동정된 땅콩 단백의 아미노산 염기서열과 대두의 염기서열 비교분석으로부터 예상 IgE binding epitope를 합성한 후, 환자혈청을 이용한 epitope inhibition IgE ELISA와 epitope direct IgE ELISA방법으로 땅콩과 대두에서의 공통 IgE binding epitope를 규명하였다. 결과: 땅콩 단백들 중 38 kDa과 23 kDa의 분획에 대한 IgE 결합반응이 대두항원에 의하여 확실히 억제되었으며, 이를 정제하여 N-termianl amino acid sequencing을 시행하여 database에 검색한 결과 38 kDa과 23 kDa 분획 모두 Ara h 3로 확인되었다. 이들 중 아직까지 IgE binding epitope가 보고되어져 있지 않은 23 kDa의 땅콩 단백 분획을 대두단백과의 아미노산 염기서열 비교분석을 통하여 2개의 예상 IgE binding epitope을 제작하였으며 환자혈청을 이용한 epitope inhibition-IgE ELISA와 epitope direct ELISA방법을 통하여 예상한 2개의 IgE binding epitope 중 하나가 몇몇 환자들에 한하여 땅콩과 대두의 공통 IgE binding epitope로 확인되었다. 결론: 우리나라 소아의 혈청 특이 IgE를 이용한 연구 결과 땅콩의 Ara h 3와 대두의 glycinin사이에 공통의 IgE binding epitope들이 여러 개 존재함을 알 수 있었으며 그 중 한 개의 IgE binding epitope을 규명할 수 있었다.