Effects of Loganin on osteoblast and osteoclast differentiation

Abstract

The maintenance of bone mass involves both bone formation and bone resorption, and imbalances between these processes can result in bone loss and, eventually, osteoporosis. We demonstrated that an ethanol extract of Cornus officinalis increased the differentiation of osteoblasts from pre-osteoblast cells and decreased the differentiation of osteoclasts from primary-cultured monocyte cells. The goals of the present study were to isolate the bioactive compound(s) responsible for the anti-osteoporotic effects of the Cornus officinalis extract and to investigate the anti-osteoporotic effects of the isolated compound(s) in vitro and in vivo. A single compound, Loganin, was isolated as the putative candidate bioactive component. Furthermore, Loganin significantly increased the activity of alkaline phosphatase (ALP) and expression of bone remodeling markers (e.g., Alp and Runx2 in) pre-osteoblast MC3T3-E1 cells and increased the formation of mineralized nodules in MC3T3-E1 cells. On the other hand, Loganin reduced the activity of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in the osteoclasts of primary-cultured monocytes from mouse bone marrow. Similarly, Loganin also increased the ALP activity and decreased the TRAP activity of co-cultured osteoblasts and osteoclasts. In vivo, Loganin improved the bone mineral density, serum OPG/RANKL ratio, and micro CT and whole-body bone scan results in Loganin-treated ovariectomized (OVX) mice. Together, these results demonstrate that Loganin effectively enhances bone formation and reduces bone resorption during bone remodeling and suggests that Loganin could be used to treat osteoporosis.

골다공증은 세계보건기구(WHO)에서 ‘골량의 감소와 미세구조의 이상을 특징으로 하는 전신적인 골격계 질환으로, 결과적으로 뼈가 약해져서 부러지기 쉬운 상태가 되는 질환’으로 정의한다. 골다공증은 호르몬의 변화, 노화, 약물복용 등의 환경 및 유전 인자들의 상호작용에 의해 발생하는 다인자성 복합 질환이며, 최근 고령화의 진전에 따른 골다공증 환자수의 급격한 증가 현상이 나타나고 있으며, 세계보건기구의 자료를 인용하면 인구 전반의 고령화 진전의 영향으로 2050년에 이르면 골다공증 유병률이 지금의 4배 정도까지 증가하게 될 것으로 예상하고 있다. 골다공증 치료를 위해서는 장기적인 약물 치료가 필요한데, 현재 많이 사용되는 골다공증 치료제로는 비스포스포네이트, 호르몬제 등이 있으나, 부작용이 있어 장기 투여가 어려우며 새로운 뼈 생성에 의한 골밀도 증가에는 큰 역할을 하지 않는다는 단점이 있다. 이에 부작용이 적어 장기간의 사용이 가능한 천연물 유래의 약물 치료제 개발에 대한 필용성이 있어왔다. 선행연구에서 66종의 약용식물 유래 에탄올 추출물을 대상으로 조골세포주(MC3T3-E1)의 분화능 촉진 효능을 탐색하여, 가장 효과가 좋은 산수유 추출물(Cornus officinalis)을 발굴하였다. 본 연구에서는 산수유 추출물에서 조골세포의 분화를 촉진하는 효능성분(bioactive compound)을 분리 ∙ 동정하고 그 효과를 in vitro와 in vivo 실험을 통해 조사하고자 하였다. 산수유 에탄올 추출물을 다양한 용매를 사용한 분획(fractionation)과 질량스펙트럼 방법을 통해 분석한 결과, 효능성분으로 Loganin을 동정하였다. Loganin이 골 형성(bone formation)에 관여하는 조골세포(osteoblast)의 분화와 골 흡수(bone resorption)에 관여하는 파골세포(osteoclast)의 분화에 미치는 영향을 각각 연구하였으며, 실제 생체 내와 유사한 환경인 조골세포와 파골세포의 공배양(co-culture) 조건에서 Loganin이 이들 세포의 분화에 미치는 영향을 연구하였다. 조골세포의 전구세포인 조골모세포주 MC3T3-E1에 Loganin을 처리하여 조골세포 분화시에 나타나는 alkaline phosphatase(ALP) 활성을 측정한 결과, 조골세포의 분화 증가의 효과가 있었으며, 석회화 결절형성(mineralized nodule formation)eh 유의하게 증가하였다. 또한, Quantitative reverse-transcription PCR (qRT-PCR)를 통해 조골세포 분화 마커인 Alp, Runx2의 mRNA 발현량을 측정한 결과, Loganin을 처리한 군에서 대조군에 비해 모두 유의하게 증가되었다. 마우스 골수에서 분리 ∙ 배양된 초대 배양 단핵세포(primary-cultured monocyte)에 Loganin을 처리하여 파골세포 분화시에 나타나는 Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 활성을 분석한 결과, 파골세포 분화 억제에 유의한 효과가 있었다. 또한, 공배양 조건에서는 Loganin의 처리에 의해 조골세포의 분화 증가와 파골세포의 분화 억제가 관찰되었다. 마지막으로, 난소를 절제한 골다공증 유도 마우스(ovariectomized, OVX) 실험을 통해 Loganin의 in vivo에서의 효과를 조사하였다. Loganin을 3가지 농도(2, 10 and 50 mg/kg/days)로 12주 동안 구강주입(oral injection) 실험을 통해, Loganin 10 mg/kg/days의 농도에서 골밀도(bone mineral density), 혈액에서의 OPG/RANKL 비율, micro-CT와 뼈 스캔(SPECT scan)에서의 뼈의 미세구조 및 뼈 굵기 등의 전반적인 골다공증 평가 자료에서 유의한 개선 효과가 있음을 증명하였다. 결론적으로, 산수유 에탄올 추출물의 효능성분인 Loganin은 조골세포의 분화 증진을 통한 뼈 형성 촉진과 파골세포의 분화억제를 통한 뼈 흡수 억제에 효능이 있음을 증명하였다. 또한, 동물실험에서 Loganin이 난소절제에 의해 나타나는 골다공증의 개선 또는 치료에 좋은 효과가 있음을 밝혔다. 본 연구결과가 향후 Loganin를 이용한 골다공증 치료제 개발에 활용될 수 있기를 기대한다.