Differentiation induction for postoperative temporal bone using human ear mastoid bone marrow and adipose-derived stem cells

Abstract

Injured bones have a limited capacity for self-repair in most cases, including otolaryngology. In the case of patients with chronic otitis media or people who need a cochlear implant surgery, the mastoid bone must be drilled out. However, it results in temporal bone defects which can cause various complications such as dizziness, accumulation of keratin debris, otorrhea, or recurrent lesions. To compensate for these disadvantages of open cavity mastoidectomy, reconstruction of the posterior wall of the external auditory canal and mastoid obliteration have been attempted. Autologous tissues, alloplastic and biosynthetic materials have all been used in mastoid obliteration. Autologous tissues are much safer and more cost-effective than alloplastic or biosynthetic materials. However, they also have limitations and are not applicable in every situation because of insufficient amounts of autologous tissues, donor site defects, and reabsorption after surgery. Mastoid bone marrow and adipose tissue can be easily obtained during the surgery without any additional invasive procedures, and also be great source of stem cell. Mastoid bone is normally characterized with air cells for gas exchange and also remains empty space after mastoidectomy. Therefore, mastoid bone requires different bone regeneration strategy from compact bones including cranial bones. Naturally, the scaffold may have to be different depending on the kinds of target bones. Artificial scaffolds must also be biodegradable, allowing extracellular matrix to occupy the empty space when the biomaterial is degraded. The aim of this study was to investigate the effectiveness of mastoid bone marrow and adipose tissue-derived stem cells, which are acquired through mastoidectomy, and to evaluate their effects on bone formation in combination with scaffold to regenerate temporal bone defects. The human mastoid bone marrow and adipose tissues showed stem cell phenotypes, and these characteristics were maintained up to passage 5. Mastoid bulla and cranial bone defects were induced in Sprague-Dawley rats and the rats were divided into five groups: (1) control, (2) human ear adipose-derived stromal cells (hEASCs), (3) hEASCs + osteogenic differentiation medium (ODM), (4) hEASCs + polycaprolactone (PCL) scaffolds, and (5) hEASCs + PCL scaffolds + ODM. Osteogenesis was evaluated by micro-computed tomography and histology. Compared with the control group, the groups transplanted with hEASCs and PCL scaffolds had significantly higher bone formation along the periphery of the mastoid bulla area. Moreover, ODM synergistically enhanced bone formation in mastoid bulla defects. Our results suggest that combining hEASCs with PCL scaffolds represents a promising method for anatomical and functional reconstruction of postoperative temporal bone defects following mastoidectomy

유양돌기 절제술(mastoidectomy)은 중이염 및 유양돌기염 환자 수술에서 병변 함기세포 제거와 재발을 막기 위해 시행된다. 이 술식은 병변이 제거되고 정상기능을 유지하며 재발률이 낮은 장점이 있으나, 공동(open cavity)으로 인해 치유기간이 길어 만성적 이루, 현훈, 각소(keratin debris) 축적, 보청기 착용 등의 문제점이 따른다. 이러한 유양돌기 절제술에 따른 공동 문제를 줄이기 위해 삭개된 유양동에 자가골분, 연골, 지방, 합성골 등을 이용하여 유양동을 폐쇄하는 방법이 적용되어 왔다. 자가조직은 합성골에 비해 안전성과 비용 측면에서 효과적임에도 불구하고, 충분한 양을 얻지 못하거나 흡수 정도를 예측하기 어렵다는 단점이 있다. 줄기세포(stem cell)는 여러 조직으로 분화할 가능성을 지닌 미분화 세포로, 유양골수(mastoid bone marrow)와 지방조직(adipose tissue)은 성체 중간엽 줄기세포를 포함하며, 유양동 삭개술시, 2 차적인 침습적 시술없이 얻기 용이한 세포 재료가 된다. 유양골은 두개골과 달리, 공기세포 (air cell)가 존재하며 수술 후 공동은 빈 공간으로 남기 때문에 유양골조직과 유사한 구조의 3 차원적 지지체 (scaffold)가 요구된다. 폴리카프로락톤 (Polycaprolactone; PCL) 은 합성고분자 재료로, 천연고분자의 스캐폴드에 비해 가격이 낮으며 분자구조와 분자량 조절이 가능해 물리, 기계적 특성 및 생분해성을 조절할 수 있는 장점을 지닌 FDA 승인된 지지체로 조직공학에서 널리 활용되고 있다. 본 연구는 유양돌기삭개술 시 획득되는 인간 유래 유양골수와 지방조직 내 줄기세포로서의 유용성을 확인하고, 유양동 결손 동물모델에 3 차원 다공성 지지체와 세포, 성장인자를 조합시켜 공동에 이식해 골 재생효과를 알아보는 것을 목표로 하였다. 유양골수와 지방조직 유래 세포에서 중간엽 줄기세포의 표면항원인 CD90, CD105, CD29 를 90% 이상 발현하며, 조혈모세포의 표면항원인 CD45 는 발현하지 않았다. 이러한 발현 양상은 5 계대(passage)까지 유지되었으며 이후 점차 감소되었다. 골, 연골, 지방, 신경, 상피세포로의 분화 유도 후 각 세포염색을 통해 관찰한 결과, 다분화능 (multi-potency) 또한 확인되었다. 동물실험은 생후 8 주령 Sprague-Dawley rat으로, 총 24 마리의 유양골과 두개골 결손모델에 (1) 대조군, (2) 귀 지방유래 세포군, (3) 귀 지방유래 세포 + 골 분화촉진 성장인자군, (4) 귀 지방유래 세포 + PCL 지지체군, (5) 귀 지방유래 세포 + PCL 지지체 + 골 분화촉진 성장인자군으로 분류하고, CT (computed tomography)와 Hematoxylin & Eosin (H&E), 골 분화 지표인 osteopontin 면역염색을 통해 골형성을 분석하였다. CT를 시행한 결과, 귀 지방유래 세포 + PCL 지지체군에서 상당한 골 분화가 관찰되었으며, H&E와 면역염색 결과에서도 유양골 결손기저부로부터 골형성이 시작되는 것을 확인하였다. 이에 골 분화촉진 성장인자군이 첨가되었을 때, 유양골 형성의 상승효과가 관찰되었다. 그러나 이러한 효과가 두개골 결손모델에서는 관찰되지 않았다. 본 연구에서는 귀 지방유래 세포와 3 차원 다공성 지지체를 이식하여 유양골 형성의 유의미한 효과를 보았다. 향후 유양돌기 절제술시 발생하는 부작용에 자가조직과 지지체를 이용한 본 기술이 유용하게 적용될 것으로 기대된다.