Identification of novel genes involved in precocious puberty by integrated genomic analyses

Abstract

Precocious puberty is a multifactorial disease that occurs in one out of 5,000-10,000 children with the appearance of secondary sexual characteristics before 8 years in girls and 9 years in boys. Early activation of the pituitary gland and gonadal (HPG) axis, regulated by hypothalamic Kiss1 and GnRH neurons, has been reported to result in precocious puberty. Both environmental and genetic factors are involved in precocious puberty. Currently, only few genes such as KISS1, KISS1R and MKRN3 have been demonstrated to be closely relate to the pathogenesis of precocious puberty; therefore, the genetic risk factors for precocious puberty remain to be identified. In this study, I aimed to identify the novel genetic biomarkers that are closely associated with an increased risk of precocious puberty and thereby, useful for the early diagnosis of the disease. Screening of the differentially expressed genes in the hypothalamus of female mice during the pubertal period was performed by whole-genome RNA sequencing using next-generation sequencing (NGS). I identified six genes that were significantly increased or decreased during the period of puberty; the expression of four genes, Gabrd, Opalin, Plg, and Trf, increased and that of two genes, Glra3 and Npw, decreased significantly in the mouse hypothalamus during the pubertal period (day 22 to day 30). These expression patterns were confirmed by quantitative RT-PCR using gene-specific primers. To verify whether the six identified genes are susceptible to precocious puberty, I conducted a candidate gene-based case-control association study using the SNP genotype and clinical data of total 669 Korean girls with precocious puberty and 300 Korean age-matched normal controls. Although no significant associations satisfying the Bonferroni-corrected significance level (p <0.0003), were observed, 43 of 1,183 SNPs located in the six genes were associated with precocious puberty (p <0.05): 8 of 245 in GABRD, 6 of 178 SNPs in GLRA3, 3 of 161 SNPs in NPW, 7 of 219 SNPs in OPALIN, 9 of 178 SNPs in PLG, and 10 of 202 SNPs in TRF. rs679749 (odds ratio=1.4160 and p=0.0034) and rs1197312 (odds ratio =0.7069 and p=0.0034) in the TRF gene were the most significant SNPs. Finally, I performed in silico pathway analysis of the six genes to investigate how these genes are directly and indirectly related to precocious puberty using the IPA program. All the six genes were closely related to precocious puberty via two or three nodes. This study provides insights into the genetic basis of precocious puberty and the identification of clinically useful genetic biomarkers for the disease.

성조숙증(Precocious puberty)은 이차 성징이 여아의 경우 8세 이전에, 남아의 경우 9 세 이전의 이른 시기에 나타나는 질환으로, 저 신장과 제 2형 당뇨병, 성인 비만 등을 초래할 수 있다. 시상하부에 존재하는 Kiss1 뉴런과 GnRH 뉴런에 의해 조절되는 HPG(hypothalamus, pituitary gland, gonadal gland) axis의 조기 활성에 의해 성조숙증이 발생하게 된다. 성조슥증은 다인자성 질환으로 유전적 요인과 환경적 요인이 함께 관여하지만, 성조숙증 환자의 50%~80%가 유전적 요인에 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 현재까지 알려진 대표적인 성조숙증 유발 원인 유전자로 KISS1, KISS1R, MKRN3 등의 유전자들이 알려져 있다. 최근 전세계적으로 성조숙증 환자가 급격히 증가하고 있어 성조숙증에 대한 관심이 증가하고 있으며, 이미 효과적인 치료제가 존재하기 때문에 조기진단이 무엇보다 중요하다. 현재 시행되고 있는 성조숙증 진단법은 조기진단에 한계가 있기 때문에 유전자 바이오마커를 사용한 조기진단의 필요성이 점점 더 커지고 있다. 본 연구에서는 성조숙증과 연관된 새로운 유전 인자를 발굴하여 조기진단 유전자 바이오마커로서의 유용성을 검증하는 것을 목표로 하였다. 먼저, 차세대연기서열분석(NGS) 장비를 이용한 전장유전체 RNA 시퀀싱을 통해 암컷 마우스의 성장 시기별(10, 12, 15, 18, 22, 26, 30, 45일) 유전자 발현 패턴을 분석하였다. 성장 시기별 시상하부와 뇌하수체 조직을 적출하여 mRNA를 추출한 후 전장유전체 RNA 시퀀싱을 수행하여, 사춘기에 해당하는 22일, 26일, 30일의 일령에서 명확한 발현량의 차이를 보이는 6종의 유전자를 동정하였다, 시상하부에서 사춘기 기간동안 발현이 유의하게 증가하는 4개의 유전자, Gabrd, Opalin, Plg, Trf와 사춘기 기간 동안 발현이 감소하는 2개의 유전자, Glra3, Npw 를 발굴하였다. 성조숙증 유발 원인 유전자이며 사춘기에서 발현량이 크게 변화되는 유전자인 Gnrh, Kiss1, Mkrn3의 발현 패턴을 확인한 결과 본 연구 방법의 신뢰성을 확인하였다. 또한, 유전자 특이적 primer 를 사용한 quantitative RT-PCR를 통해 발굴된 유전자들의 사춘기 기간에서의 발현 패턴의 변화를 확인하였다. 다음은, 발굴된 6종의 유전자들이 성조숙증과 연관성이 있는지 증명하기 위해 후보유전자 연관성분석(candidate gene association study)을 시행하였다. 669명의 한국인 성조숙증 여아 환자와 300명의 정상 여아의 SNP 유전형 및 임상정보를 사용하였으며, 6종의 유전자에 존재하는 1,183개의 SNP 에 대한 환자-정상군(case-control) 후보유전자 연관성분석 결과, 6종의 유전자에 존재하는 43개의 SNP 들이 성조숙증과 통계적으로 유의한 연관성(p <0.05)을 나타내었다. 즉, GABRD 의 245개 SNP 중 8개, GLRA3 의 178개 SNP 중 6, NPW 의 161개 SNP 중 3개, OPALIN 의 219개 SNP 중 7개, PLG 의 178개 SNP중 9개, TRF의 202개 SNP중 10개가 통계적으로 유의한 연관성이 있음이 확인되었다. 이중 가장 유의성이 높은 SNP 는 TRF 유전자에 위치하는 rs679749 SNP(odds ratio=1.4160, p=0.0034)와 rs1197312 SNP(odds ratio =0.7069, p=0.0034)이었다. 또한, ingenuity pathway analysis program 을 이용한 in silico 네트워크분석(pathway analysis)을 통해 6종의 유전자들이 성조숙증과 밀접한 관련이 있음을 확인하였다. 요약하면, 마우스의 사춘기에서 발현량이 현저하게 변화되는 6종의 유전자를 발굴하였으며, 총 969명의 한국인 여아 코호트(환자군 669명, 정상군 300명)의 후보유전자 연관성분석과 in silico 네트워크분석을 통해 이들 유전자들이 성조숙증과 밀접한 연관성이 있음을 증명하였다. 이들 유전자들은 성조숙증의 발병기전에 관여하는 유전 요인의 규명에 크게 기여할 것으로 사료되며, 향후 성조숙증 조기진단의 유전자 바이오마커로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.