Functional study of susceptibility genes to precocious puberty identified by genome-wide association analysis in Korean girls

Abstract

Central precocious puberty results from the premature activation of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis and is clinically defined by the development of secondary sexual characteristics before the age of 8 years in girls and 9 years in boys. Incidence of precocious puberty in Korean girls is estimated to be 3.3 to 50.4 per 100,000 girls during the study period (2004–2010), and recent studies have reported that it is increasing significantly in Korea. Genome-wide association studies (GWASs) are very powerful tools for the identification of susceptibility loci for diseases and traits. Our previous case-control GWAS with 300 controls and 699 cases identified one SNP (p-value=1.1×10-8), which was below the genome wide significance level (p<5.0×10-8) and had a very high disease odds ratio (OR>2.0). In this study, I aimed to identify the gene(s) effected by this SNP and elucidate how the SNP affects precocious puberty in vitro. Because, three genes, EGR1, HSPA9, and ETF1, were located close to this SNP, I firstly investigated whether the mRNA expression patterns of these genes in mouse hypothalamus altered during puberty. EGR1 and ETF1 gene expression were significantly changed 22 ~30 days after birth (puberty period). Next, I overexpressed these genes in mouse hypothalamus cells GT1-7, gonadotrophin-releasing hormone (GnRH)-producing cells, and then assessed the gene expression levels of the precocious puberty enhancing markers Gnrh and Kiss1r. Only Etf1 over expression significantly reduced Gnrh and Kiss1r expression. Notably, the activated form of ERK (phosphorylatedERK) which is involved in GnRH production was decreased in an Eff1 dose dependent manner. These results suggest that ETF1 gene expression levels may be closely engaged in the pathogenesis of precocious puberty in girls.

성조숙증 (Precocious puberty) 은 다인자성 질환으로 유전적 요인과 환경적 요인이 함께 관여한다. 유전적인 요인으로는 인종, 가족력, 유전자 등 이 있으며. 환경적인 요인으로는 비만, 신체 형상, 내분비계 교란물질 (endocrine disrupting chemical; EDC) 등 이 있다. 성조숙증 환자의 50%~80%가 유전적 요인에 영향을 받는 것으로 알려져 있으나 아직까지 정확하게 연관성이 밝혀진 유전자가 많지 않다. 현재까지 알려진 대표적인 성조숙증 유발 관련 유전자로 KISS1, KISS1R, MKRN3 등이 있다. 최근 국내 성조숙증 환자가 급증함에 따라 질환의 진단과 치료에 대한 관심이 증가하고 있다. 특히, 적절한 치료를 위해서는 바이오마커를 활용한 조기진단이 중요하다. 본 연구에서는 성조숙증과 연관성이 있는 새로운 유전 인자를 발굴하여 조기진단 바이오마커로서의 유용성을 검증하는 것을 목표로 하였다. 먼저, 선행연구에서 한국인 여아 성조숙증 연구 코호트 (환자군 669명, 정상군 300명)를 통한 임상자료와 단일염기다형성 (SNP) 유전형 자료를 이용한 case-control 전장유전체연관성분석 (GWAS)을 통해 Bonferroni correction p-value 유의성 (p < 5×10-8)을 통과하는 1개의 SNP 와 Suggested p-value 유의성 (p < 1×10-5)을 통과하는 7개의 SNP을 포함한 총 8개의 SNP을 발굴하였다. GWAS 결과에서 가장 높은 유의성을 나타낸 rs10900855 SNP (p = 1.1×10-8)의 500 Kbp 내에 위치한 3개의 유전자 EGR1, HSPA9, ETF1를 본 연구의 후보유전자로 선정하였다. 암컷 마우스의 성장시기별 (10, 22, 30, 36일) 시상하부 조직을 적출하여 mRNA를 추출한 후 선정된 후보유전자들의 유전자 발현 패턴을 조사하였다. 마우스의 사춘기 시기(22~30일) 동안 Egr1은 발현량이 유의하게 증가하였으며, Etf1 은 발현량이 유의하게 감소하는 양상을 보였다. Hspa9는 마우스 시상하부에서는 발현량의 변화가 거의 없었다. 다음으로, 마우스 시상하부 유래의 생식샘자극호르몬 방출호르몬 (GnRH)을 분비하는 세포주인 GT1-7 세포를 이용하여 후보유전자의 과발현에 의한 GnRH 분비 관련 경로 (pathway) 변화를 조사하였다. Egr1과 Hspa9의 과발현은 Gnrh와 Kiss1r의 mRNA발현량에 영향을 주지 않았지만, Etf1의 과발현은 Gnrh와 Kiss1r의 발현량을 현저하게 감소시켰다. 또한, Etf1의 과발현은 Etf1 단백질 농도 의존적으로 phospholyated-ERK를 현저하게 감소시켰다. 이러한 결과는 성조숙증 case-control GWAS에서 가장 높은 유의성을 나타낸 rs10900855 SNP가 ETF1 유전자와 연관된 SNP일 가능성이 높으며, ETF1 유전자의 발현량의 변화는 성조숙증과 밀접한 관련이 있음을 시사한다. 마지막으로, 성조숙증 case-control GWAS에서 가장 높은 유의성을 나타낸 rs10900855 SNP을 포함 총45개의 SNP (p ≤ 1×10-4)에 대한 다중회귀분석을 진행하였으며, 이를 통하여 정확도 (precision) 값 상승에 영향을 미치는 SNP을 분석하여 최종적으로 23개의 SNP를 성조숙증 진단 바이오마커로 선정하였다. 이들 23개의 SNP를 이용한 성조숙증 발병 예측의 민감도는 66%, 특이도는 88.6%, 정확도는 81.2%롤 나타났다. 이러한 연구결과로부터, rs1090855 SNP을 포함한 23개의 SNP는 향후 예측율이 높은 성조숙증 조기진단 바이오마커로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.