A study on the lipid kinase PIP5Kα that regulates autophagy flux

Abstract

Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) present in the plasma membrane is an essential lipid regulator of many cell physiological processes at the cell surface. PI(4,5)P2 is mainly produced by the type I phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase (PIP5K) family members comprising PIP5Kα, PIP5Kβ, and PIP5Kγ It is known that each PIP5K isoform plays a distinct role at specific membrane compartments. Here, we studied a potential role of PIP5Kα in the regulation of autophagy. We generated PIP5Kα knockout (KO) gastric cancer cells using CRISPR/Cas9 system and examined effects of PIP5Kα KO on autophagic flux triggered by serum starvation. Activation of autophagy was monitored by immunoblot analysis of the conversion of LC3I to LC3II. We found that LC3II levels in PIP5Kα KO cells remained relatively high compared to those in control KO cells during the time course of serum starvation. Reconstitution of wild type PIP5Kα, but not of its catalytically inactive PIP5Kα, in PIP5Kα KO cells recovered a normal autophagic flux, an increase and then decrease in LC3II levels. In good agreement with these findings, an inhibitor of PIP5Kα led to accumulation of LC3-II at the late stage of autophagic flux. These results suggest that PIP5Kα-dependent PI(4,5)P2 generation is required for autophagy. Currently, we are testing the possibility that PIP5Kα is engaged in the step of autolysosome formation. In addition, we confirmed that PIP5Kα binds to ATG5, one of the ATG(Autophagy related gene) protein. And ATG5 found stronger binding in the PIP5Kα CAT domain. So We are searching how the binding of ATG5 and p PIP5Kα affect autophagy.

원형질 막에 존재하는 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5) P2)는 세포 표면에서 많은 세포 생리학적 과정의 필수 지질 조절제이다. PI (4,5)P2는 주로 PIP5Kα, PIP5Kβ 및 PIP5Kγ를 포함하는 type I phosphatidy-linositol 4-phosphate 5-kinase (PIP5K) family에 의해 생성된다. 각각의 PIP5K 동형 단백질들은 특정한 막 구획에서 뚜렷한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 여기서, 우리는 autophagy의 규제에 PIP5Kα의 잠재적인 역할을 연구하였다. 우리는 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 PIP5Kα knockout (KO) 위암 세포를 만들었고 PIP5Kα KO의 효과를 혈청 결핍에 의해 유발된 자가포식작용 흐름에 대해 조사하였다. 자가포식작용의 활성화는 면역 블롯 분석을 통하여 LC3-Ⅰ에서 LC3-Ⅱ로 전환되는 것을 볼 수 있었다. 우리는 시간 별로 혈청 결핍을 하였을 때, 대조군에 비해서 PIP5Kα KO 세포에서 LC3-Ⅱ 수준이 상대적으로 높게 유지된다는 것을 발견하였다. PIP5Kα KO세포에서 촉매 적으로 비활성화된 것이 아닌 야생형PIP5Kα를 재구성하여 자가포식작용을 회복시켰으며, LC3-Ⅱ의 수준이 증가된 후 감소되었다. 이러한 결과와 잘 일치하여 PIP5Kα의 억제제는 자가포식작용의 후기 단계에서 LC3-Ⅱ가 축적을 유도하였다. 이러한 결과를 통하여PIP5Kα에 의한 PI(4,5)P2생성은 자가포식작용에 필요하다는 것을 시사한다. 현재 우리는 autolysosome 형성 과정에서 PIP5Kα가 관여할 가능성을 시험해보고 있다. 또한 우리는 ATG (autophagy-related gene) 단백질 중 하나인 ATG5와 PIP5Kα가 결합하는 것을 확인하였다. 그리고 ATG5가 CAT 도메인에서 더 강한 결합을 하는 것을 보았다. 그래서 우리는 ATG5와 PIP5Kα의 결합이 어떻게 자가포식작용에 영향을 미치는지 찾고 있는 중이다.