Opposing Role of TFII-I isoform in regulation of human tyrosine expression during dopaminergic neurogenesis

Abstract

In our previous study we showed that NURR1, orphan nuclear receptor dynamically represses human tyrosine hydroxylase (hTH) transcription in precursor cells, whereas it transactivates hTH expression in dopaminergic (DA) neuronal cells. Here we focused on function of TFII-I isoforms, TFII-IΔ and TFII-Iγ acting as cofactor of NURR1 during dopaminergic neurogenesis. We found that two isoforms showed different function on hTH promoter regulation. TFII-IΔ strongly bound on hTH promoter enriched with H3K4/K27me3 bivalent chromatin marks and repress hTH activity in dose dependent manner while in SH-SY5Y cells TFII-Iγ strongly bound to H3K27ac enriched region on promoter leading hTH transcription activation. Moreover, based on mutations of TFII-I binding sites E-box and Inr we found that TFII-I∆ mediates hTH transcription repression via Inr site in F3 cells. In SH-SY5Y cells, TFII-Iγ showed strong binding to hTH promoter in a tertiary complex with NURR1 consisting NBRE-A, E box and Inr element to transactivate hTH transcription. Overall, our results revealed that two alternative splicing TFII-I forms may play an opposing role in modulating hTH gene expression during DA neurogenesis.

고아 핵 수용체인 NURR1은 중뇌 도파민성 신경세포 발생과정에서 도파민 합성의 첫 단계를 매개하는 타이로신 하이드록실라제 발현에 핵심적인 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. 우리의 선행 연구에서 인간의 도파민성 신경세포 발생 과정에서 NURR1이 타이로신 하이드록실라제 발현을 조절할 때 신경 전구세포에서 억제시키는 반면 도파민성 세포에서는 활성화시키는 상반된 역할을 하는 것을 확인했고 NURR1의 이러한 작용과 연관이 있을 것이라 추측되는 파트너로서 TFII-I를 발굴하였다. 또한 중뇌 발생 과정 중에 TFII-I의 4가지 아형 중 TFII-IΔ가 TFII-Iγ로 발현이 스위치 되는 것을 확인하여 두 아형이 Nurr1과 상호작용하여 어떻게 타이로신 하이드록실라제 발현을 조절하는지에 대한 연구를 진행하였다. 결과로서 TFII-IΔ는 F3 cell에서 타이로신 하이드록실라제 발현을 감소시켰고 TFII-Iγ는 SH-SY5Y cell에서 발현을 증가시키는 상반된 작용 양상을 보였다. ChIP assay를 통해 F3 cell에서는 주로 TFII-IΔ가, SH-SY5Y cell에선 TFII-Iγ가 조절영역에 결합하여 전사 조절에 관여하고 있음을 확인하였고 TFII-IΔ는 전사 활성화와 억제에 관여하는 크로마틴에 bivalent 하게 결합하는 반면 TFII-Iγ는 전사 활성화에 관여하는 크로마틴에만 결합하는 것을 확인하여 TFII-I가 도파민 발생 과정에서 전구세포에서 전사를 중지시키고, 분화 후 활성화시키는 조절 기작에 관여함을 확인하였다. 또한 NBRE-A주변에 나란히 존재하는 두 TFII-I 결합 영역인 E-box와 Initiator가 전사 조절에 어떻게 관여하는지를 luciferase assay와 EMSA assay를 통해 확인해 본 결과 F3 cell에서는 TFII-IΔ가 Initiator에 강하게 결합하여 억제에 관여하고 있었으며 SH-SY5Y cell에서는 TFII-Iγ가 Initiator와 E-box에 동시에 결합하여 Nurr1과 3합체를 형성하는 것으로 전사 활성화에 관여하고 있는 것을 확인할 수 있었다.