Roles of Cotl1 in learning and memory function

Abstract

Mitochondria play an essential role in energy generation and cellular quality control. Mitochondrial morphology dynamics regulated by mitochondrial fission and fusion machinery is crucial for nervous system development. The actin cytoskeleton is involved in mitochondrial fission and synaptic plasticity network. This study aimed to elucidate the role of coactosin like F-actin binding protein 1 (Cotl1) in learning and memory functions. I first examined mitochondrial morphology in COTL1-downregulated human neuronal SK-N-SH cells using confocal microscopy. COTL1 knockdown using RNA interference led to an abnormal F-actin distribution and morphology, and elongated mitochondria. Next, I conducted behavioural tests exploring learning and memory functions in Cotl1 knockout (Cotl1-/-) mice. Behavioural experiments including Morris water maze test, passive avoidance test, and excitatory postsynaptic potential record, in Cotl1-/- mice demonstrated learning and memory function impairments. In silico pathway analysis of differentially expressed genes (DEGs) using the ingenuity pathway analysis program in hippocampus tissues of Cotl1-/- mice indicated that networks of the DEGs from the hippocampus of Cotl1-/- mice were involved in brain functions like development of central nervous system, embryo development, behaviour and neurological diseases, indicating an important role of Cotl1 in neuronal functions. Doublecortin (Dcx) plays an important role in the regulation of F-actin formation in developing neurons and Dcx deficiency contributes to actin defects, resulting in selectively deficient axon guidance. Dcx expression was downregulated in granule cells in hippocampus dentate gyrus (DG) of Cotl1-/- mice. Restoration of Cotl1 through viral vector injection to the hippocampus DG significantly improved learning and memory functions in Cotl1-/- mice. Collectively, the results demonstrate that learning and memory impairments in mice caused by Cotl1 loss are due to Dcx reduction in hippocampus. This study may provide insights into the functional significance of Cotl1 in Dcx-mediated learning and memory function.

미토콘드리아는 아데노신삼인산(ATP)을 생성하는 세포내 소기관으로서 세포에서 에너지 생산 외에도 매우 다양한 역할을 담당하고 있다. 미토콘드리아는 융합(fusion)과 분열(fission)의 균형에 의해 그 모양과 수가 조절되고 있으며, 이러한 미토콘드리아의 형태적인 다이나믹스(mitochondrial morphological dynamics)는 세포자멸사(apoptosis), 세포노화(cellular senescence), 세포대사(cellular metabolism), 세포주기(cell cycle), 발생(development) 등의 세포의 삶과 죽음을 포함한 세포의 운명 결정과 직결된 다양한 생명활동에 관여한다는 사실이 밝혀졌다. 미토콘드리아는 세포골격 트랙(cytoskeletal track)의 축을 따라 이동하여 상호 네트워크를 형성하고 있기 때문에, 주요 세포골격 단백질인 F-actin이 미토콘드리아의 기능과 구조를 유지하는데 중요한 역할을 한다는 사실이 알려져 있다. 특히, F-actin과 미토콘드리아의 상호 관계가 신경세포에서의 시냅스 전달(synaptic transmission) 과 연관되어 있음이 밝혀졌다. 이에, 본 연구에서는 F-actin 결합 단백질의 한가지이며 미토콘드리아 fission에 중요한 역할을 하는 것으로 최근 밝혀진 coactosin-like protein 1 (Cotl1)이 뇌의 학습 및 기억에 관여하는지를 연구하고자 하였다. 연구방법으로는 공초점현미경(confocal microscopy)을 이용한 미토콘드리아 형태 관찰과Cotl1 유전자 제거 마우스(knockout mouse)(Cotl1-/-)를 이용한 학습 및 기억 관련의 행동실험을 실시하였다. 인간SK-N-SH 신경세포에RNA 간섭(RNA interference) 방법으로 COTL1 유전자의 발현을 억제하였을 때, F-actin의 형태가 비정상적으로 변화되고 미토콘드리아의 길이가 현저히 길어진 것을 관찰하였다. 모리스 수중미로 실험(Morris water maze test), 수동회피실험(passive avoidance test), 흥분성 연접후 전위 측정실험(excitatory postsynaptic potential record)의 행동실험 결과 Cotl1-/- 마우스는 학습 및 기억 기능이 정상 마우스(wild type)에 비해 유의적으로 감소되어 있음을 밝혔다. Cotl1-/- 마우스와 정상마우스의 해마(hippocampus) 조직에서 차세대염기서열분석(next-generation sequencing)을 이용한 RNA sequencing을 통해 차별발현유전자(differentially expressed gene, DEG)를 발굴하여 인실리코 경로분석(in silico pathway analysis)을 수행한 결과, “학습(learning)” 및 “기억(memory)”과의 연관성이 높은 유전자가 많이 발견되었으며, 특히 doublecortin(Dcx) 유전자와의 밀접한 연관성이 있음이 밝혀졌다. 이 결과를 바탕으로 Western blotting으로 분석한 결과 Cotl1-/- 마우스는 해마 조직에서 Dcx 단백질의 현저한 발현 감소를 확인하였다. Cotl1 유전자 결핍이 학습과 기억에 영향을 준다는 가설을 직접적으로 증명하기 위해 Cotl1 유전자가 클로닝(cloning)되어 있는 바이러스 벡터를 Cotl1-/- 마우스의 해마 치상회(dentate gyrus) 부위에 국소적으로 주입하여 발현을 확인한 후 학습 및 기억 관련의 행동실험을 수행하였다. 그 결과, Cotl1이 주입된 Cotl1-/- 마우스의 학습 및 기억 기능이 유의하게 회복되었고, 해마 치상회 부위에서의 Dcx 단백질의 발현량이 유의하게 증가되었음을 밝혔다. 상기 결과를 요약하면, Cotl1 유전자 knockout 마우스는 학습 및 기억 장애의 표현형을 나타내며, 이는 해마의 치상회 부위에서의 Dcx 발현량 감소와 밀접한 관련이 있음을 밝혔다. 이러한 결과는 미토콘드리아 fission에 관여하는 F-actin 결합 단백질인 Cotl1이 뇌의 학습과 기억에 중요한 역할을 담당하고 있음을 시사한다.