Protection effect of EC on radiation-induced cell death of auditory cell in vitro and in vivo

Abstract

"방사선은 현재 암 치료용으로 널리 사용되고 있으며 특히 두경부암의 경우 생명을 유지시키는데 중요한 장기와 구조물이 복잡하게 위치하고 있어 종양발생으로 인한 중대한 기능 손실과 외모의 변형이 문제시 되고 있다. 그러나 방사선치료는 인해 정상 조직이나 기관의 모양과 기능은 정상 상태로 유지시키면서 악성 종양조직은 선택적으로 파괴시켜 널리 사용되고 있다. 그러나 불행히도 두경부암에서 방사선을 조사하면 청력이 손실된다고 보고되어 있다. 따라서 본 실험에서는 방사선에 의해 유도되는 청력손실에 따른 녹차추출 Epicatechin(EC)의 효과에 대해 확인하고자 하였다.

먼저 청각와우세포인 HEI-OC1 세포로 세포 생존률을 측정하였으며 annexin-V와 PI로 이중염색을 시행한 뒤 FACS를 시행하여 세포 고사율을 확인하였으며, 미토콘드리아 막 투과성의 변화와 활성산소의 변화를 측정하였다. 또한 TUNEL assay와 투과 전자 현미경을 사용하여 세포고사를 현미경하에서 관찰하였다. 또한 기전을 확인하기 위하여 Western blot을 시행하였으며, caspase 3 활성도도 측정하였다. 생체 실험으로는 지브라피쉬(zebrafish)를 이용하여 방사선에 의한 청각기관의 변화를 보기 위해 지브라피쉬 신경소구(neuromast)의 변화와 그에 따른 EC의 효과를 확인하였으며, 이를 주사 전자 현미경하에서도 관찰하였다. 또한 백서를 이용하여 뇌간유발전이 청력검사를 시행하여 방사선에 의한 청력의 손실과 EC의 효과를 객관적 기능검사로 확인하였다. 세포 생존율을 측정한 결과 방사선의 양이 증가할수록 세포 생존율이 감소하였으며 20Gy의 방사선에 EC를 농도별로 처리한 결과 EC의 농도와 비례하여 세포 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. FACS를 시행한 결과 방사선만 처리한 군에서는 세포 고사율이 증가한 반면 방사선과 EC를 함께 처리한 군에서는 세포 고사율이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 미토콘드리아 막 투과성과 활성산소의 변화를 측정한 결과에서도 방사선을 처리한 군에서는 증가하였다가 EC를 함께 처리한 군에서는 감소한 것을 확인하였다. TUNEL assay에서는 방사선을 처리한 군에서는 DNA가 손상되어 FITC가 염색된 것을 많이 관찰할 수 있었으며 EC를 함께 처리한 군에서는 FITC가 염색된 부분이 많이 감소하여 DNA손상이 보호된다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 방사선에 의한 시간에 따른 세포의 기전을 Western blot을 통하여 분석하였다. p53과 MAPK pathway인 p38, ERK, JNK를 확인하였으며, 15분에 시행한 실험에서 가장 강한 발현을 보였으며, 이 결과를 토대로 방사선에 따른 EC의 변화의 기전을 확인하였다. 결과상 EC는 p38의 발현을 약간 감소시켰으나, 주된 변화는 JNK의 변화가 가장 두드러져 JNK pathway를 통한 청각보호작용이 일어나는 것으로 판단되었다. 또한 caspase 3 활성도를 측정하여 세포의 고사를 확인하였다. 방사선에 의해 caspase 3의 활성도가 증가하였으며 EC와 함께 처리한 군에서는 caspase 3의 활성도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 생체 실험인 지브라피쉬를 통하여 방사선에 의해 신경소구가 작아지고 변형되는 것을 Yo pro-1 염색을 통하여 형광현미경하에서 관찰하였으며, EC에 의해 보호되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이를 주사 전자 현미경으로 관찰한 결과 방사선을 조사한 군에서는 kinocilium이 잘려져 있는 반면 EC를 함께 처리한 군에서는 방사선에 의해 손상 받은 kinocilium이 보호되는 것을 확인하였다. 또한 백서를 이용하여 뇌간유발전이 청력검사를 시행한 결과 방사선만 처리한 군에서는 청각역치가 증가되는 것을 확인할 수 있었는데 EC를 함께 처리한 군에서는 청각역치가 정상보다는 높았지만, 방사선처리군에 비해 감소하는 것을 확인할 수 있어 방사선에 의해 손상된 청각세포가 EC에 의해 기능적으로 보호된다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 HEI-OC1에서 EC가 방사선에 의해 유도되는 활성산소의 생성을 낮추고, 미토콘드리아 막 투과성을 소실을 억제하여 산화스트레스로 인한 세포의 손상을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 앞으로 EC에 의한 항산화 작용에 따른 세포 보호 기전의 구체적인 기전 분석과 동물실험을 통하여 조직학적인 변화가 필요하며, 이러한 연구결과를 토대로 방사선에 의한 청각기능을 보호할 수 있는 치료약물 개발에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있을 것이라 생각한다."