Regulatory Regions required for β-Defensin-2 Up-regulation by Interleukin-1α in the Human Middle Ear Epithelial Cell Line

Abstract

BACKGROUND AND OBJECTIVES: In the middle ear, the innate immunity is important because of less immune cell. Among the innate immunities beta-defensin-2 is known to play an important role in the immune function of middle ear. But, it is unclear about signal transduction pathway and gene regulatory region of human betadefensin-2 (hBD-2). MATERIALS AND METHOD: The expression of hBD-2 by IL-1a in HMEEC (Human Middle Ear Epithelial Cell) was detected by RT-PCR. The luciferase-expressing vector containing diverse lengths of the hBD-2 5' flanking region made by the progressive unidirectional deletion was transferred to HMEEC. We analyzed the function of 5’ flanking region by luciferase activity measured using luminometer after corresponding substrate was supplemented to the cell lysate. RESULTS: hBD-2 was upregulated by IL-1a in HMEEC-1. The treatment of IL-1a upregulates the activity of promoter 7.60±1.45 (average ± standard deviation) folded in 2.7kpb sized 5’ flanking region, 3.81 ± 0.78 folded in 1.1kbp, and 4.00 ± 0.73 folded in 500bp, respectively. CONCLUSION: These results indicate there are two effective gene regions that regulate hBD-2 expression by IL-1a between 2.7kbp and 1.1kbp, and 500bp upstream of the translation starting point of hBD-2 in HMEEC-1.

연구목적: 디펜신(Defensin)은 항균펩타이드의 하나로, 특히 베타 디펜신-2(β defensin-2)는 병원균이나 cytokine과 같은 염증 자극에 의하여 그 발현이 크게 증가한다. 인체 중이점막 상피세포주 (HMEEC)에서 인터루킨-1알파 (interleukin-1α)에 의하여 인체 베타 디펜신-2 (hBD-2)의 발현이 증가되는 것과 이 현상에 Src-dependent Raf MEK1/2 ERK 신호전달경로가 관여하는 것은 보고되어있으므로, 신호전달경로 하위의 전사인자나 그 결합부위가 있는 유전자 조절부위(gene regulatory region)를 조사하여 향후 상위 신호전달물질과의 연계를 연구하는데 발판을 마련하고자 하였다. 재료 및 방법: Human papilloma virus type16의 oncogene인 E6/E7 gene을 포함하여 만든 정상 인체 중이점막 상피세포주(HMEEC-1)를 이용하였다. hBD-2 유전자의 발현이 염증물질에 의하여 증가하는 것을 알아보기 위해 HMEEC- 1이 70% confluent일 때 IL-1α를 처리하고 total RNA를 추출하여 c-DNA로 전환한 뒤 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 시행하였다. 단방향 유전자 절단을 이용하여(unidirectional DNA deletion) vector construct를 만든 뒤, 전기영동과 염기서열분석을 통해 5’flanking 부위의 크기를 알아내었고 필요한 vector construct를 충분히 확보하였으며, 각각을 transfection 시킨 뒤, luminometer를 이용, luciferase의 활성도를 측정하여 5’flanking 부위의 유전자 조절 기능을 분석하였다. 결과: HMEEC-1에 IL-1α를 처치하였을 때 hBD-2의 mRNA 발현이 현저히 증가한 반면, 대조 유전자인 β actin의 발현은 변화가 없었다. IL-1α를 처치할 경우 2.7kbp 크기의 hBD-2 5’flanking 부위와 1.1 kb, 0.5 kbp 크기의 hBD-2 5’flanking 부위의 luciferase 발현을 증가시켜 hBD-2 5’flanking의 크기 별로 유전자 조절 활성도 비교가 가능하였다. 이와 같은 결과는 hBD-2의 translation 시작부위보다 상위 2.7kbp와 1.1kbp 사이 및 상위 0.5kbp 이내 두 곳에 중요한 유전자 조절 부위가 존재함을 의미하였다. 결론: 인체 중이점막 상피세포에서 IL-1α에 의한 hBD-2의 발현증가에 관여하는 유전자 조절부위가 5’ flanking 부위에 두 곳이 존재하는 것을 알 수 있었다.