Characterization of Variable Region Structures and Antigen-Binding Properties of OxLDL-Specific Human Monoclonal Antibody Isolated from PBMC and Atherotic Plaques of Atherosclerosis Patients

Abstract

PURPOSE: Atherosclerosis is an inflammatory response to the accumulated cholesterol in the artery wall. Oxidative modification of low-density lipoprotein (LDL) plays an important role in the pathogenesis of atherosclerosis and the oxidized LDL (oxLDL) may represent a target for autoantibodies involved in the pathogenesis of the disease. The aim of this study was; first, analysis of the Ag-binding characteristics of anti-oxLDL autoantibodies isolated from atherosclerosis patients' PBMC; second, determination of the VH and VL sequences of the Fab produced from the plaques and comparison them with those from PBMC. This study will improve the knowledge of the mechanism which are related to the pathogenesis of atherosclerosis and provide a basis for developing of new therapeutics which can regulate the pathogenesis. MATERIALS AND METHODS: Soluble forms of the anti-oxLDL Fabs isolated from PBMC were purified using Ni-NTA agarose, and their affinities and specificities to native LDL and oxLDL were measured by surface plasmon resonance. Using phage display, we have also cloned anti-oxLDL monoclonal antibodies from atherosclertic plaques. The VH and VL sequences of the Fab produced from the plaques were compared with those from PBMC. The total RNA were isolated from atherotic plaques. PCR was then used to amplify cDNA synthesized from RNA and overlapping extention PCR was performed to produce a Fab library. Fab genes were cloned into the phagemid vector, pComb3X-ss which contains gene Ⅲ coding minor coat protein pⅢ of phage. Recombinant pComb3X-ss containing the Fab genes was transformed into E. coli XL1-Blue to produce recombinant phage Fab. phage Fabs which showed high affinities to oxLDL have been selected, and their phagemids have been purified for sequencing the variable regions of the Fab. To analyze activation-induced cytidine deaminase (AID) mRNA transcripts by RT-PCR, cDNA which synthesized from RNA isolated from atherosclerotic plaques was used as template. RESULTS: The affinities of the anti-oxLDL Fabs isolated from PBMC were measured. It is shown that the purified eight anti-oxLDL Fabs originated from PBMC are all specific to oxLDL; the affinities to oxLDL (K_(D) : 1.77 × 10^(-6) ∼ 9.27 × 10^(-8)) are 10~1000 folds higher than to native LDL (K_(D) : 2.59 × 10^(-4) ∼ 1.07 × 10^(-7)) in each Fab. Fabs which include more positively charged amino acids than negatively charged amino acids tend to have higher affinities to oxLDL, although there are some exceptions. The VH and VL sequences of the anti-oxLDL autoantibodies isolated as recombinant phage Fabs from the atherosclerotic plaques were determined and compared with those from PBMC. The Fabs isolated from the plaques tend to be similar to those from PBMC; The VH3 gene family, JH4 segment, Vκ1 gene family and Jκ1 gene segment are frequently used; The length of CDR3 of the heavy chain are heterogeneous; The ratios of replacement-to-silent mutation (R/S) in the CDRs was higher than those in the FRs of most of VH and VL; Many positively charged amino acids occurs in the CDRs of VH and VL of the antibodies. Comparison of the genes of Fabs with their germline counterparts revealed that overall similarity of VH to germline genes was 84~98%, those of VL was 86~98%. Evidence of somatic hypermutation and class switch recombination was also obtained by analyzing the local expression of mRNA transcripts encoding AID in the atherosclerotic plaque. CONCLUSION: The oxLDL-specific human monoclonal antibody Fabs which have 10~1000 folds higher affinities to oxLDL than LDL were isolated from atherocsclerosis patients' PBMC. The Fabs which include more positively charged amino acids than negatively charged amino acids tend to have higher affinities to oxLDL. The human monoclonal antibodies containing binding properties with affinity to oxLDL higher than to LDL may be used as potential agents for detection or evaluation of oxLDL in human serum or exploring the characteristics of atherosclerotic artery. Sequences of anti-oxLDL Fabs isolated from atherosclerotic plaques tend to have similar characteristics to those from PBMC of the patients. Many positively charged amino acids occurs in the CDRs of VH and VL, suggesting it might be one of the properties that allow binding to negatively charged oxLDL. The overall results might suggest that in the both PBMC and atherotic plaques of atherosclerosis patients, anti-oxLDL antibodies are produced from B cell clones which have been selected through antigen-driven process and undergone affinity maturation, and are originated from similar B cell clones. It is additionally suggested that somatic hypermutation and class switch recombination might be occurred in the B cells found in the patients' plaques. In this study, we analyzed the molecular structures of human anti-oxLDL monoclonal autoantibodies to investigate the origin and mechanism of the antibody production which are related to the pathogenesis of atherosclerosis. We also produced human monoclonal antibodies as forms of Fab which are specific to oxLDL and may be useful in specific detection of oxLDL in human body.

목적: 동맥경화증은 동맥의 혈관 벽에 콜레스테롤이 축적되고, 여러 면역반응이 관찰되는 염증반응이다. 산화 저밀도 지질단백질은 이러한 염증면역반응을 유발하고 지속시키는 주요 항원 중의 하나로 알려져 있다. 본 연구의 목적은 첫째, 동맥경화증 환자의 말초혈액에 존재하는 항-산화 저밀도 지질단백질 단클론 자가항체의 항원 결합 특성을 규명하고, 항체의 유전자 구조와의 연관성을 분석하는 것이다. 둘째, 동맥경화증 환자의 말초혈액과 동맥 경화반에 존재하는 항-산화 저밀도 지질단백질 단클론 자가항체의 유전자 및 일차구조를 규명 및 비교분석 함이다. 이 연구를 통하여 궁극적으로는 동맥경화증의 발병기전 및 질병진행과정의 면역학적인 측면에서의 이해를 증진시키고 질병의 진행과정 조절과 같은 새로운 치료기법의 개발에 기초 자료를 제공하고자 한다. 재료 및 방법: 동맥경화 환자의 혈액에서 phage display 방법으로 분리해 낸 항-산화 저밀도 지질단백질 단클론 자가항체를 용해성 Fab로 발현시킨 후, Ni-NTA agrose를 이용하여 순수 정제하였고 surface plasmon resonance를 이용하여 친화력을 측정하였다. 동맥경화 환자의 경화반에 존재하는 항-산화 저밀도 지질단백질 단클론 자가항체 또한 phage display 방법으로 클로닝 및 발현하고, 환자의 혈액에서 분리해낸 자가항체와 유전자 및 단백질의 구조를 비교분석 하였다. 동맥경화증 환자의 경화반으로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 인간 Fab primers를 사용하여 overlapping extension PCR을 수행하여 Fab 라이브러리를 만들었다. Fab 유전자를 phage의 minor coat protein을 코딩하는 gene Ⅲ를 가지고 있는 phagemid 벡터 (pComb3X-ss)에 클로닝하여 만든 phagemid로 대장균 XL1-Blue를 변형시켜 재조합 phage Fab를 생산하였다. 산화 저밀도 지질단백질을 항원으로 사용하여 이에 특이하게 결합하는 phage Fab를 선별하였다. 선별된 phage Fab의 항체 가변부위를 염기 서열화 하고 항체유전자 데이터베이스를 사용하여 분석하였다. 또한, 환자의 경화반에서 추출하여 합성한 cDNA를 주형으로 하여 AID mRNA 전사물의 발현 유무를 RT-PCR로 확인하였다. 결과: 말초혈액에 순환하는 항-산화 저밀도 지질단백질 자가항체의 산화 저밀도 지질단백질과 저밀도 지질단백질에 대한 친화력을 측정하였다. 순수 정제해 낸 8개의 Fab의 산화 저밀도 지질단백질에 대한 친화력 (K_(D) : 1.77 × 10^(-6) ∼ 9.27 × 10^(-8))은 저밀도 지질단백질에 대한 친화력 (K_(D) : 2.59 × 10^(-4) ∼ 1.07 × 10^(-7)) 보다 약 10~1000배 정도 높게 나타났다. 예외는 있지만, 이들 중 CDR 부위에 양전하의 아미노산이 음전하의 아미노산보다 많이 존재하는 클론이 산화 저밀도 지질단백질에 더 강한 친화력을 가지는 경향을 보였다. 경화반에 존재하는 항-산화 저밀도 지질단백질 자가항체를 재조합 phage Fab로 발현하여 각 항체 가변부위의 염기서열의 특징을 밝히고, 말초혈액에 순환하는 자가항체와의 차이점을 비교 분석하고자 하였다. 경화반에서 분리해 낸 클론들과 혈액에서 분리해 낸 클론들은 유사성을 가지는 것으로 나타났다. 즉, VH3 유전자 family와 JH4 segment, Vκ1 유전자 family와 Jκ1 유전자 segment를 빈번하게 사용하는 것과 CDR3-VH의 길이가 다양하고 VH와 VL 모두에서 FRs 보다 CDRs에서 더 높은 R/S 비율의 경향을 보이는 점 등이다. 또한 경화반에서 분리한 항체들의 VH와 VL의 CDR부위에서도 양전하를 띈 아미노산이 많이 발견 되었다. 또한, 가장 높은 유사성을 보이는 germline 유전자 염기서열과 비교했을 때 각 자가항체 염기서열의 유사성이 VH에 있어 84~98%, VL에 있어서는 86~98%로 높은 돌연변이율을 보였다. 동맥 경화반에서 class switch와 체세포 과돌연변이의 증거중의 하나가 될 수 있는 activation-induced cytidine deaminase 유전자의 전사 또한 9명의 환자 시료에서 모두 확인되었다. 결론: 동맥 경화증 환자의 말초혈액에서 분리해낸 항-산화 저밀도 지질단백질 단클론 자가항체들은 저밀도 지질단백질보다 산화 저밀도 지질단백질에 10~1000배 높은 친화력을 가지므로 산화 저밀도 지질단백질에 특이적인 인간 단클론 Fab가 분리되었다. 이들 중에서 CDR 부분에 양전하의 아미노산이 음전하의 아미노산보다 많이 존재하는 클론에서 산화 저밀도 지질단백질과 더 강한 결합력을 가지는 경향을 보였다. 이 항체들은 임상적으로 체내 여러 부위에 존재하는 산화 저밀도 지질단백질을 탐지하거나 평가할 수 있는 중요한 시약으로 응용될 수 있을 것이다. 경화반에서 분리해낸 자가항체와 혈액에서 분리한 자가항체와의 비교분석에서 경화반에서 분리한 클론들과 혈액에서 분리한 클론들은 유사성을 보였다. 많은 클론들의 VH와 VL의 CDR부위에서 양전하를 띈 아미노산이 많이 발견 되었는데, 이것은 음전하를 띄는 산화 저밀도 지질단백질 항원과 결합할 수 있는 특성 중 하나로 제시될 수 있다. 이 결과들로부터, 전반적으로 동맥경화 환자에서 생산되는 말초혈액에 순환하는 항체와 동맥 경화반에 존재하는 항-산화 저밀도 지질단백질 자가항체는 B 세포 발달과정에서 antigen-driven 과정을 통하여 선택되고 친화력 성숙을 거친 B 세포 클론들로부터 생산되며, 이 두곳에서 발견되는 항체가 유사한 B 세포 클론에서 유래하였을 가능성을 제시할 수 있다. 또한, 동맥 경화반에 존재하는 B 세포 클론들에서 class switch recombination과 체세포 과돌연변이가 일어남을 또한 제시할 수 있다. 본 연구에서는 동맥경화증 환자에서 나타나는 항-산화 저밀도 지질단백질 단클론 자가 항체의 분자적 구조를 분석함으로써, 질병 관련 항체의 생성기원과 다양성 규명에 필요한 기초 자료를 제시하고자 하였다. 또한 산화 저밀도 지질 단백질에 특이적으로 결합하여 임상적으로 산화 저밀도 지질단백질을 탐지하는데 유용할 수 있는 인간 단클론 항체를 생산하였다.