Epigallocatechin-3-gallate and tolfenamic acid induces apoptosis and growth inhibition in head and neck cancer : Involvement of NSAID activated gene-1

Abstract

With over 500,000 cases worldwide and a high mortality rate, head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in men. The 5-year overall survival rate for patients with advanced HNSCC is around 30%, which is essentially unchanged from the rate recorded two decades ago in spite of various treatment trials. Therefore, preventive strategies are desirable, and much research is currently devoted to chemoprevention that aims to prevent HNSCC progression at an early stage. However, which chemopreventive agents are the safest and most effective against HNSCC remains unclear. It is of clinical importance to investigate the efficacy of anti-oxidant and nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) as chemopreventive agents. At present, the chemopreventive agents that have been most widely investigated as chemopreventive agents are NSAIDs and anti-oxidants.Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), a major polyphenolic constituent of green tea, possesses remarkable chemopreventive and therapeutic potential against various types of cancer, including HNSCC. In addition to, NSAIDs have been clinically used as chemopreventive agents for familial adenomatous polyposis, with the mode of action being the inhibition of cyclooxygenase-2 (COX-2). However, chemopreventive and antitumorigenic activities of NSAIDs have also been observed in COX-2-deficient cells, indicating that NSAIDs also exert their anticancer effect through a mechanism other than COX-2 suppression. One such mechanism involves the induction of NSAID-activated gene-1 (NAG-1). Non-steroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1 (NAG-1), a TGF-β superfamily protein, is shown to be induced by several anti-tumorigenic compounds and to exhibit pro-apoptotic and anti-tumorigenic activities. In this study, NAG-1 induction during tolfenamic acid or EGCG induced apoptosis was evaluated to determine if they were involved in their anti-cancer activity on HNSCC. Both of the compounds reduced HNSCC viability and induced apoptosis in a dose-dependent manner. The induced apoptosis was coincident with the expression of NAG-1. Overexpression of NAG-1 enhanced the apoptotic effect of EGCG and tolfenamic acid, whereas suppression of NAG-1expression by small interfering RNA attenuated apoptosis. Also we identified that p53 is required for EGCG- mediated activation of NAG-1 by reporter assays using the luciferase constructs containing the NAG-1 promoter. Subsequently, we found that ataxia telangiectasia mutated (ATM) plays an important role in activating these pro-apoptotic proteins (NAG-1 and p53) and cell cycle inhibitor (p21). Furthermore, the antitumor effects of EGCG and tolfenamic acid was observed in tumor-bearing xenograft and syngeneic mouse models which is accompanied with induction of apoptotic cells and NAG-1 expression in tumor tissue samples. The results of this study revealed for the first time that EGCG and tolfenamic acid induces apoptosis via NAG-1 expression in HNSCC. Especially we identified that EGCG induced NAG-1 expression is dependent with ATM/p53. These results present an additional mechanism for antitumor effects of EGCG and tolfenamic acid.

두경부암은 전세계적으로 매년 50만명이 발생하여 남자에서는 여섯 번째로 흔한 암으로 알려져 있으며, 진행성 두경부암인 경우 사망률이 높은 특성을 갖고 있다. 지난 20년간 다양한 치료법을 시도했음에도 불구하고, 진행성 두경부암의 5년 생존율은 30% 전후로 크게 향상되지 못하엿다. 이러한 치료적 한계를 극복하고자 최근 암을 예방하거나 조기에 치료하고자 하는 치료전략이 주목 받고 있으며 다양한 연구가 진행중이다. 그러나 두경부암에서 어떠한 예방 약물 (chemoprevention)이 안전하고 효과가 있는지에 대한 부분은 아직 미진한 상황이다. 이러한 예방 약물로서 항산화물질과 비스테로이드성 소염제에 대한 효능에 대한 연구가 다양하게 이루어지고 있다. 본 연구에서는 녹차에 들어있는 대표적인 항산화물질이고, 주된 polyphenolic 물질인 Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)와 비스테로이드성 소염제로서 임상에서 사용되고 있는 tolfenamic acid의 항암효과 및 기전에 관한 내용을 소개하고자 한다. EGCG는 이미 두경부암을 포함한 다양한 암에서 암 예방효과 및 치료효과에 대해 다양하게 연구되었고, 연구되고 있고, tolfenamic acid를 포함한 비스테로이드성 소염제에 대해서도cyclooxygenase-2 (COX-2)기전을 통해 familial adenomatous polyposis 등의 전암병 변에서 암예방효과가 있다는 것이 다양하게 연구되어 왔다. 흥미로운 것은 이러한 비스테로이드성 소염제의 항암효과가 COX-2가 결여된 세포주에서도 보고되면서, COX-2억제를 통한 암억제외에 다른 기전에 대한 연구가 진행되었다. 이러한 새로운 항암기전에 대한 연구 중에 하나가 TGF-β superfamily protein의 하나인 Non-steroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1 (NAG-1)에 관한 것이다. NAG-1은 다양한 암에서 비스테로이드성 소염제를 포함한 다양한 항암물질에서 발현이 유도되며, 세포사멸 유도와 항암활성에 관여하는 것으로 밝혀지고 있다. 본 연구에서 두경부암에서 EGCG와 비스테로이드성 소염제인 tolfenamic acid에 의해 유도되는 세포사멸현상을 평가하고 이에 관여된 기전을 NAG-1을 중심으로 분석하였다. 본 연구의 결과를 보면, 다양한 두경부암에서 EGCG와 tolfenamic acid에 의해 농도의존적으로 세포사멸이 증가됨을 확인하였고 이러한 세포사멸과 일치하게 NAG-1의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 두경부암세포주에 NAG-1을 형질 주입(transfection)하여 NAG-1을 과발현시키면 다른 약물처리 없이도 세포사멸이 일어나며, EGCG와 tolfenamic acid를 함께 처리해주면 세포사멸이 더 증가하는 것으로 확인되었다. 또한 small interfering RNA를 통해 NAG-1의 발현을 억제하면, EGCG와 tolfenamic acid에 의해 유도되는 세포사멸이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. NAG-1 promoter 가 담긴 luciferase construct를 다양하게 제작하여 Repoter assay를 시행한 결과 EGCG에 의해 유도되는 NAG-1의 발현에는 p53이 중요 역할을 하는 것으로 확인되었고, 이러한 과정에서 ataxia telangiectasia mutated (ATM)이 proapoptotic protein (NAG-1과 p53), cell cycle inhibitor인 p21의 활성에 중요한 역할 한다는 것을 확인하였다. 이러한 EGCG와 tolfenamic acid의 항암효과는 in vivo xenograft와 syngeneic mouse model 에서도 효과적인 것으로 확인되었고, in vivo에서 얻어진 종양조직 분석에서 EGCG와 tolfenamic acid를 처리한 군에서는 암조직의 현저한 세포사멸이 관찰되고, NAG-1이 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 본 연구결과를 통해 두경부암에서 EGCG는 ATM/p53-dependent 한 NAG-1의 발현을 통한 세포사멸이 일어난다는 것을 확인하였고, tolfenamic acid의 경우도 두경부암 세포 사멸에 NAG-1 발현의 증가가 중요한 기전임을 확인할 수 있었다. 본 연구는 그동안 연구가 미진했던 두경부암에서 EGCG와 tolfenamic acid의 항암효과와 기전을 새롭게 제시한 연구로, 본 연구의 결과로 볼 때, 향후 EGCG와 tolfenamic acid가 난치성 두경부암에서 새로운 치료법의 하나로서 혹은 병합치료제의 하나로서 가능성이 있을 것으로 판단한다.